人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基

由普諾賽技術(shù)團隊精心優(yōu)化的人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基，經(jīng)篩選配比的無血清添加物及其他輔助成分。該產(chǎn)品適用于人間質(zhì)干細胞無血清條件的培養(yǎng)；可維持人間質(zhì)干細胞良好的增殖速率，并保持良好的分化能力。

實驗數(shù)據(jù)：

1.使用普諾賽的間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞，細胞表型如何？

用流式細胞儀檢測細胞表面抗原：CD19(0.35%)、CD34(1.23%)、CD45(1.08%)呈陰性表達；CD90(99.94%)、CD105(97.02%)呈陽性表達。

2.通過臍帶組織貼塊法分離間充質(zhì)干細胞需要幾天？

7-10天，可見細胞爬出；第14天，細胞可傳代；之后，每2-3天細胞可傳代一次。

【產(chǎn)品用途與描述】

人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基可用于多種來源的人類間充質(zhì)干細胞的原代細胞分離及細胞傳代培養(yǎng)，同時還能保持其多向分化的潛能，如人骨髓間充質(zhì)干細胞（BM-hMSC)、人脂肪間充質(zhì)干細胞（AT-hMSC）、人臍帶間充質(zhì)干細胞（UCM-hMSC）等。

使用本產(chǎn)品無需添加血清或血清替代物。

人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基化學成分明確、無血清、無動物源成分。產(chǎn)品批間差異小，非常適用于培養(yǎng)哺乳類干細胞，包括臍帶干細胞，骨髓干細胞，脂肪干細胞等間充質(zhì)干細胞。產(chǎn)品嚴格無菌，無病毒和支原體，性能穩(wěn)定，使用該培養(yǎng)基能使干細胞在理想營養(yǎng)平衡狀態(tài)下進行多代擴增而不發(fā)生分化（10代以內(nèi)）。

【產(chǎn)品特點】

1、可維持人類間充質(zhì)干細胞良好的增值速率；

2、保持良好的分化能力；

3、經(jīng)過微生物檢測（細菌、真菌、霉菌及支原體）、PH檢測、滲透壓和內(nèi)毒素檢測；

4、不含任何動物源的蛋白成分。

【產(chǎn)品規(guī)格與保存】

【產(chǎn)品穩(wěn)定性】

1、所有的產(chǎn)品都需要避光保存；

2、所有產(chǎn)品一旦超過標簽注釋的有效期，必須放棄使用；

3、配制成完全培養(yǎng)基后，避光保存在2-8℃可存放3-4周；

4、為了更好的使用效果，請勿對試劑進行反復凍融。

【產(chǎn)品主要成份】

人間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基的主要組成成分：氨基酸，維生素、無機鹽、白蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素、微量元素等。

【產(chǎn)品使用方法】

1、人間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基準備

將人間充質(zhì)干細胞無血清生長添加劑(hMSCGs)在2-8℃過夜融化，按1:100比例加入基礎培養(yǎng)基中，即成為人間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基。

溫馨提示：人間充質(zhì)干細胞完全培養(yǎng)基2-8℃避光條件下，可保存30天。若小量、多次使用，建議您將人間充質(zhì)干細胞無血清生長添加劑（hMSCGs）分裝后，保存于-5~-20℃冰箱，可避免培養(yǎng)基不必要的浪費。

2、人間充質(zhì)干細胞復蘇（以T-75瓶為例）

①從冰箱中取出完全培養(yǎng)基，在生物安全柜或超凈臺中吸取適量（如T-75瓶：10-15 mL）完全培養(yǎng)基沿上表面加入間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)瓶中，切勿沖到細胞培養(yǎng)瓶底面，即：細胞生長面。然后慢慢將細胞培養(yǎng)瓶平放，在37℃、恒溫CO2培養(yǎng)箱中放置5-10分鐘后使用。

溫馨提示：請嚴格按照此步驟操作，否則可能會出現(xiàn)細胞培養(yǎng)瓶中細胞生長空白區(qū)域，即所謂的“生長空洞”。多數(shù)用戶使用的不是專用的預包被細胞培養(yǎng)瓶，而是普通的細胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿，其表面環(huán)境并不利于無血清培養(yǎng)環(huán)境下的間充質(zhì)干細胞貼壁。37℃放置5-10分鐘，可讓培養(yǎng)基中的促貼壁物質(zhì)更好地與細胞培養(yǎng)瓶底部結(jié)合，使得間充質(zhì)干細胞的貼壁能力增強，降低“生長空洞”出現(xiàn)的概率。

②從液氮中取出凍存的間充質(zhì)干細胞，迅速將凍存管放入37℃水浴中，快速融解。

溫馨提示：盡可能避免水沒過管帽，以減少污染的風險；要快速完成細胞復蘇過程（盡量控制在1分鐘內(nèi)），融化過程時間過長，會造成復蘇后細胞活性較差。

③用70%-75%酒精消毒凍存管外壁，在生物安全柜或超凈臺中打開凍存管，用吸管/移液器將細胞凍存懸液緩慢移入裝有5-10 mL細胞完全培養(yǎng)基的15 mL離心管中（在這一過程請盡可能避免產(chǎn)生氣泡）。

溫馨提示：為了減少細胞損失，往細胞凍存管中加入1 mL完全培養(yǎng)基，稍微吹打，用吸管/移液器將這1 mL的細胞懸液吸入離心管中，再用吸管/移液器將離心管中的細胞輕輕吹打混勻。

④1200 rpm離心5 min，棄上清，加入2 mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，臺盼藍染色計數(shù)，按密度2×10⁴ cells/cm²將細胞接種至步驟①中孵育完的細胞培養(yǎng)瓶中，添加細胞時，將細胞培養(yǎng)瓶豎立，細胞懸液直接加到底部，切忌沖到細胞培養(yǎng)瓶底面。

⑤輕輕搖晃細胞培養(yǎng)器皿，使細胞均勻分布，混勻后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

⑥24 h后，更換新鮮的完全培養(yǎng)基（溫育至37℃）。

3、人間充質(zhì)干細胞傳代（以T-75瓶為例）

①在顯微鏡下觀察細胞，當細胞融合度達到80-90%，即可傳代。

溫馨提示：細胞融合度請勿超過90%。很多傳代后的細胞大比例死亡，是由于傳代前細胞生長過密（融合度過高），導致細胞消化異常（細胞整片或成片脫落），加之隨后的不當操作（如用移液器反復吹打成片細胞使其成為單個細胞），此機械損失過程會嚴重損害細胞膜，引發(fā)大比例的細胞死亡；間充質(zhì)干細胞經(jīng)凍存后再次使用時，尤為明顯。

②預處理細胞培養(yǎng)瓶，處理方法同細胞復蘇中的步驟①。

③在生物安全柜或超凈臺中，棄去細胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入5-10 mL PBS清洗細胞后棄去，再加入2 mL 0.05%胰酶-EDTA消化細胞。

④在顯微鏡下觀察到細胞變圓時，立即加入5 mL胰酶抑制劑終止消化。

⑤用移液器輕輕吹打瓶壁上還未完全脫離的細胞，并輕輕吹打混勻，使細胞完全分散。

⑥將細胞懸液轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，1200 rpm離心5 min。棄上清，加入2 mL細胞完全培養(yǎng)基重懸細胞，臺盼藍染色計數(shù)，按細胞密度2×10⁴ cells/cm²，將細胞接種至細胞傳代②步驟中孵育完的細胞培養(yǎng)瓶中，添加細胞時，將細胞培養(yǎng)瓶豎立，細胞懸液直接加到底部，切忌沖到細胞培養(yǎng)瓶底面。

⑦輕輕搖晃細胞培養(yǎng)器皿，使細胞均勻分布，混勻后，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

4、人間充質(zhì)干細胞凍存

①用0.05%胰酶-EDTA消化待凍存的細胞，加入胰酶抑制劑終止消化并離心，重懸后進行細胞計數(shù)。

②1200 rpm離心5 min，棄上清。

③根據(jù)細胞計數(shù)情況，緩慢加入適量冷的無血清凍存液（無血清凍存液可即拿即用或置于冰袋備用），調(diào)整細胞密度在1×10⁶ cells/mL左右。

④輕輕地重懸細胞，將重懸均勻的細胞按等份加入到滅菌的凍存管中（需提前做好標記），旋緊凍存管蓋。

⑤迅速將凍存管放入程序降溫盒中，然后將凍存盒直接放入-80℃冰箱。

⑥過夜放置后，將細胞從-80℃冰箱轉(zhuǎn)移至液氮罐中長期保存。

客戶問答：

1.之前一直使用DMEM/F12+胎牛血清養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞，可以直接轉(zhuǎn)到普諾賽的間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中嗎？

含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中后可正常生長，但是無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞一般要比含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞偏瘦。

2.之前一直用含DMEM/F12（含BSA）+血清替代物養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞，可以直接轉(zhuǎn)到普諾賽的間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基中嗎？

含血清替代物培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)入無血清培養(yǎng)基中后可正常生長，無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞與含血清替代物培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞相似。

CM-SC01.pdf