HCT 116細(xì)胞很好消化，一般消化1~2min就可以，但是由于細(xì)胞生長(zhǎng)速度非?？欤瑓R合度達(dá)到80%以上細(xì)胞就會(huì)開(kāi)始擁擠，單個(gè)細(xì)胞形態(tài)變小，細(xì)胞之間的邊界變得模糊，這種過(guò)度擁擠的狀態(tài)會(huì)影響最后的消化分散效果。

要將細(xì)胞消化分散好，可以參考一下兩點(diǎn)建議進(jìn)行處理：

1. 培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞密度不要過(guò)高，80%~90%即可傳代，確保細(xì)胞不會(huì)過(guò)度密集；

2. 消化的時(shí)候胰酶量不要太多，一般T25瓶加1mL胰酶，輕輕晃動(dòng)將瓶底覆蓋后吸出多余的胰酶，保留0.5mL左右胰酶消化，消化過(guò)程中不要晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，避免細(xì)胞沒(méi)分散好就從瓶底脫落。

這是細(xì)胞培養(yǎng)條件適應(yīng)的問(wèn)題，ATCC的HK-2使用的是無(wú)血清培養(yǎng)基K-SFM，突然更換成DMEM/F12+10%FBS來(lái)培養(yǎng)，可能會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞不適應(yīng)以及狀態(tài)變差的情況。正確的辦法是先用原本的培養(yǎng)條件K-SFM擴(kuò)增好之后，再嘗試更換培養(yǎng)基。更換培養(yǎng)基時(shí)，建議先將兩種培養(yǎng)基按比例混合使用后，再慢慢更換成想要的培養(yǎng)基。

常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)用到的DMEM、1640、F-12K等培養(yǎng)基緩沖體系為NaHCO₃，需要用CO₂進(jìn)行平衡，而培養(yǎng)SF9用的昆蟲(chóng)培養(yǎng)基不含這種成分，在CO₂存在的情況下會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基變酸，影響細(xì)胞生長(zhǎng)。所以SF9培養(yǎng)的環(huán)境是100%空氣，27℃~28℃，飽和濕度，直接將培養(yǎng)箱CO₂濃度調(diào)為0即可，并非必須用密閉的培養(yǎng)瓶。

細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間久了，狀態(tài)出現(xiàn)變化其實(shí)是比較常見(jiàn)的現(xiàn)象，細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中需要控制的變量太多，任何環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題都可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差或者培養(yǎng)失敗。一般建議在細(xì)胞傳代3~5代，狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行適當(dāng)凍存，后續(xù)培養(yǎng)出現(xiàn)異常情況也可以用凍存的細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)救。

選擇血清的標(biāo)準(zhǔn)，就是能把手頭在養(yǎng)的細(xì)胞養(yǎng)好就行，所以選擇的方法就是在準(zhǔn)備更換血清批次前先用試用裝，確定該批次的血清培養(yǎng)自己的細(xì)胞是沒(méi)有問(wèn)題的，然后再進(jìn)行購(gòu)買。注意要在當(dāng)前批次血清用完之前就準(zhǔn)備下個(gè)批次血清的篩選，避免出現(xiàn)選取篩選效果不好又沒(méi)有合適血清使用的情況。

細(xì)胞出現(xiàn)裂解死亡可以從以下三個(gè)方面進(jìn)行排查：

一是檢查細(xì)胞是否存在污染，細(xì)菌、真菌和支原體污染都有可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡；

二是檢查使用的培養(yǎng)基是否存在質(zhì)量問(wèn)題。如PH值、滲透壓出現(xiàn)異常也會(huì)導(dǎo)致裂解死亡，但是一般實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有檢測(cè)條件，可以嘗試更換培養(yǎng)基廠家或批號(hào)進(jìn)行培養(yǎng)，如果后續(xù)培養(yǎng)正常則可能是培養(yǎng)基原因?qū)е碌模?/p>

三是培養(yǎng)箱環(huán)境是否出現(xiàn)問(wèn)題。如培養(yǎng)箱溫度過(guò)高，水盤(pán)干了等情況也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，特別是培養(yǎng)箱水盤(pán)，如果干了會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基蒸發(fā)加快，滲透壓升高從而導(dǎo)致細(xì)胞裂解死亡。

實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)用過(guò)的試劑和耗材等廢棄物都屬于危險(xiǎn)廢棄物，處理方法是統(tǒng)一收集后，用專用的滅菌鍋消毒處理（如果沒(méi)有專用的滅菌鍋，就用84消毒液等進(jìn)行消毒后統(tǒng)一存放），然后交由有資質(zhì)進(jìn)行危廢處理的單位進(jìn)行處理，避免對(duì)環(huán)境造成污染。

要看是用的什么培養(yǎng)條件培養(yǎng)的。如果是適應(yīng)了血清培養(yǎng)的HK-2貼壁正常，一般不容易漂；如果是K-SFM培養(yǎng)的HK-2，貼壁過(guò)程比較慢，也容易有漂浮的細(xì)胞。

K-SFM培養(yǎng)基因?yàn)闆](méi)有血清中促進(jìn)細(xì)胞貼壁的成分，所以培養(yǎng)的大多數(shù)細(xì)胞都會(huì)存在貼壁困難的情況，在培養(yǎng)前可以先用明膠或多聚賴氨酸等對(duì)培養(yǎng)瓶進(jìn)行包被，增強(qiáng)細(xì)胞貼壁能力，另外在傳代之后2~3天盡量不要去移動(dòng)細(xì)胞。

漂浮的細(xì)胞一般情況下是可以收集后繼續(xù)培養(yǎng)的，但是在培養(yǎng)基中懸浮時(shí)間太長(zhǎng)可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞活力慢慢下降。培養(yǎng)2~3天時(shí)，如果大部分細(xì)胞貼壁，只有少量懸浮可以不用處理；但是如果是大部分細(xì)胞懸浮，只有少量貼壁，可以在換液過(guò)程中把上清中的細(xì)胞離心后單獨(dú)處理。

Hep G2細(xì)胞的生長(zhǎng)特點(diǎn)就是呈島狀生長(zhǎng)，并且島狀生長(zhǎng)的細(xì)胞擴(kuò)張能力有限，長(zhǎng)到一定大小之后就會(huì)堆積生長(zhǎng)。要想細(xì)胞分散均勻，一方面是需要保證細(xì)胞消化過(guò)程中分散良好，另外一方面接種的初始密度不宜過(guò)低，否則就會(huì)有大面積的空白區(qū)域。

另外如果實(shí)驗(yàn)需要Hep G2為分散良好的單層細(xì)胞，可以用多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶后培養(yǎng)，細(xì)胞將會(huì)呈單層分散的形式生長(zhǎng)，但是形態(tài)跟不包被時(shí)差異比較大，會(huì)變成長(zhǎng)梭形細(xì)胞。

一般細(xì)胞用胰酶消化完之后使用完全培養(yǎng)基中止，起作用的主要是其中的血清成分，可以抑制胰酶的活性，所以理論上講也是可以直接用血清中止，只是比較浪費(fèi)。另外如果培養(yǎng)的細(xì)胞是用的無(wú)血清培養(yǎng)基，那么在中止時(shí)就不能使用完培中止，而應(yīng)該選用胰酶抑制劑。

這要看具體是什么細(xì)胞，如果細(xì)胞本身就存在少量不同形狀的細(xì)胞，則是正常；如果原本形態(tài)正常，但是突然出現(xiàn)形狀變化，可能是培養(yǎng)條件改變導(dǎo)致的，需要在更換培養(yǎng)條件時(shí)注意。

細(xì)胞正常的形態(tài)圖片可以從兩個(gè)途徑獲取，一是在購(gòu)買細(xì)胞的機(jī)構(gòu)官網(wǎng)查詢，或索要細(xì)胞正常狀態(tài)圖片進(jìn)行參考；二是可以查詢國(guó)內(nèi)外權(quán)威的數(shù)據(jù)庫(kù)，可以參考：https://web.expasy.org/cellosaurus。