細(xì)胞學(xué)堂 | 解密星形膠質(zhì)細(xì)胞：原代分離實(shí)操精要
星形膠質(zhì)細(xì)胞（Astrocytes）是大腦中重要的支持性細(xì)胞，具有多種生物學(xué)功能。鑒于其在神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)損傷和神經(jīng)發(fā)育中所發(fā)揮的關(guān)鍵作用，星形膠質(zhì)細(xì)胞已成為神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療干預(yù)的理想靶點(diǎn)。
本期細(xì)胞學(xué)堂將為您介紹星形膠質(zhì)細(xì)胞的背景和原代星形膠質(zhì)細(xì)胞分離方法，幫助您快速了解神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，順利展開(kāi)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。
一、星形膠質(zhì)細(xì)胞特性
在體外培養(yǎng)條件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞通常呈梭形或多角形的貼壁形態(tài)。通過(guò)經(jīng)典的金屬浸鍍技術(shù)（銀染色）可顯示其星形結(jié)構(gòu)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞的胞體發(fā)出分支狀突起，延伸至神經(jīng)元和血管周圍，形成一個(gè)復(fù)雜的支持性網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖1）。
圖 1. 中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元和毛細(xì)血管的關(guān)系示意圖（圖片來(lái)自網(wǎng)絡(luò)）
二、生物學(xué)作用
01 神經(jīng)元支持功能：星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)三重突觸與神經(jīng)元相互作用，調(diào)控突觸傳遞，并調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞和基底膜的活動(dòng)，從而維持神經(jīng)元代謝和血流[1]。
02 神經(jīng)保護(hù)悖論：在病理?xiàng)l件下，星形膠質(zhì)細(xì)胞可形成膠質(zhì)疤痕，限制炎癥和軸突再生，同時(shí)分泌神經(jīng)毒性脂質(zhì)和因子，促進(jìn)神經(jīng)元死亡或誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。
03 神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié)：成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)可塑性，影響視覺(jué)系統(tǒng)的閉合期重新開(kāi)放，顯示出其在神經(jīng)可塑性中的重要性。
04 神經(jīng)炎癥樞紐：星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥中起核心作用，通過(guò)分泌炎癥因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)，參與阿爾茨海默?。ˋD）等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[2，3]。
三、星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物與功能解析
01 GFAP（膠質(zhì)纖維酸性蛋白）：星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性標(biāo)志物，其表達(dá)水平與細(xì)胞活化狀態(tài)呈正相關(guān)，廣泛用于檢測(cè)和研究星形膠質(zhì)細(xì)胞的分布和功能[3-4]。
02 S100B：特異性高表達(dá)于灰質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞，用于區(qū)分灰質(zhì)和白質(zhì)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞，同時(shí)作為星形膠質(zhì)損傷的生物標(biāo)志物。
03 SOX10：表達(dá)于星形膠質(zhì)細(xì)胞前體和成熟星形膠質(zhì)細(xì)胞中，是研究星形膠質(zhì)細(xì)胞分化和發(fā)育的常用標(biāo)記物。
04 GLAST和GLT-1：這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要負(fù)責(zé)谷氨酸的清除，是星形膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元代謝中不可或缺的功能標(biāo)志物。
05 AQP4（水通道蛋白4）：在星形膠質(zhì)細(xì)胞的血管周足中高度表達(dá)，參與腦水腫和腦水代謝調(diào)節(jié)。
四、研究應(yīng)用
• 學(xué)習(xí)與記憶機(jī)制：星形膠質(zhì)細(xì)胞調(diào)節(jié)記憶印跡神經(jīng)元突觸活動(dòng)，釋放D-絲氨酸增強(qiáng)NMDA受體功能，促進(jìn)記憶形成。
• 神經(jīng)退行性疾?。?/strong>在阿爾茨海默?。ˋD）和帕金森病（PD）中，星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥因子和神經(jīng)毒性物質(zhì)，影響神經(jīng)元存活，與Aβ斑塊形成和多巴胺能神經(jīng)元功能相關(guān)。特別是，在AD中，星形膠質(zhì)細(xì)胞的GFAP和S100B水平升高，提示神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性變化[5]。
• 脊髓損傷：星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和膠質(zhì)疤痕形成是損傷后的典型反應(yīng)，GFAP和PCNA等標(biāo)記物的表達(dá)顯著增加[6]。
• 癲癇：星形膠質(zhì)細(xì)胞異常激活與顳葉癲癇的發(fā)生有關(guān)，GFAP和SOX10的表達(dá)變化表明其在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用[7]。
• 神經(jīng)毒性研究：利用星形膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行藥物和環(huán)境毒素篩選，評(píng)估其對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性。
• 神經(jīng)再生和修復(fù)：在脊髓損傷和腦卒中后，星形膠質(zhì)細(xì)胞形成膠質(zhì)瘢痕，分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，促進(jìn)修復(fù)和再生。
• 神經(jīng)元成熟和腦類器官：星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌因子促進(jìn)神經(jīng)元成熟，支持腦類器官構(gòu)建，模擬真實(shí)大腦結(jié)構(gòu)。
五、原代分離培養(yǎng)
星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代分離技術(shù)是研究其生理與病理機(jī)制的重要技術(shù)。本實(shí)驗(yàn)以Sprague-Dawley大鼠（出生1-3 d）為研究對(duì)象，從大腦皮層組織中分離星形膠質(zhì)細(xì)胞，具體步驟如下：
1、取材操作
01 取新生大鼠，斷頭，從頭骨正中剖開(kāi)頭骨，取出完整大腦，放入預(yù)冷的PBS內(nèi)；
02 用顯微剪、顯微鑷，剝離大腦皮質(zhì)；
03 用顯微鑷在解剖鏡下剝離大腦皮質(zhì)腦膜，或者將皮質(zhì)組織放在無(wú)菌濾紙上，來(lái)回滾動(dòng)2次即可清理腦膜。
04收集處理完的皮質(zhì)組織，剪成1-3 mm3的小塊。
2、組織處理與消化
01 加入3-5倍組織體積消化酶，37℃，水浴震蕩，消化10 min；
02 加入FBS終止消化，用移液器反復(fù)吹打至組織分散；
03 依次用100目、200目細(xì)胞篩過(guò)濾，除去大組織和腦微血管組織；
04 收集濾液，經(jīng)1200 rpm，5 min，離心獲得細(xì)胞沉淀；
05 用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按照5-10×105/瓶，接種在T25瓶?jī)?nèi)。
3、細(xì)胞分離
大腦皮質(zhì)組織經(jīng)酶消后，直接貼壁培養(yǎng)，為混合細(xì)胞，包含星形膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞等；其中星形膠質(zhì)占約48%，小膠質(zhì)占約11%，神經(jīng)元占約40%，還有1%其他細(xì)胞。
接種培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，可以去除部分神經(jīng)元細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)1周左右，可獲得純度較高的星形膠質(zhì)細(xì)胞：
純化方法1
消化傳代，去除小膠質(zhì)（小膠質(zhì)無(wú)法增殖，難消化，多次傳代，即可純化）。
純化方法2
將培養(yǎng)瓶密封，放在搖床上，200 rpm，震蕩48 h，去除漂浮的小膠質(zhì)細(xì)胞，剩余貼壁的即為高純度星形膠質(zhì)細(xì)胞。
4、細(xì)胞鑒定
原代分離的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GFAP免疫熒光鑒定，純度可達(dá)到90%（見(jiàn)圖2）。大鼠神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)10 d，具有細(xì)長(zhǎng)突起、突起分支多且廣泛延伸，胞體小且形成網(wǎng)絡(luò)連接的星狀結(jié)構(gòu)，符合星形膠質(zhì)細(xì)胞典型特征（見(jiàn)圖3）。
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| DAPI | GFAP | Merge |
圖2. 大鼠神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞免疫熒光鑒定，200×
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圖3. 大鼠神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，200× （左：培養(yǎng)3 d；右：培養(yǎng)10 d）
注意事項(xiàng)
» 所有器械耗材試劑保證無(wú)菌，在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行操作。
» 操作全程需要維持在4℃低溫，放在冰盒上操作。
» 腦膜需要清理干凈，否則會(huì)引入成纖維、微血管等雜細(xì)胞。
» 操作時(shí)間盡量縮短，操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能導(dǎo)致組織缺血死亡或裂解自消化等，進(jìn)而影響細(xì)胞活率。
» 消化時(shí)注意細(xì)胞裂解產(chǎn)生的DNA團(tuán)塊，需要用DNA酶處理，否則黏連細(xì)胞，阻塞濾網(wǎng)過(guò)濾，極大降低細(xì)胞得率。
以上是關(guān)于星形膠質(zhì)細(xì)胞的背景介紹及原代分離操作的解析。為幫助大家更好地開(kāi)展神經(jīng)疾病相關(guān)研究，普諾賽®提供了多款原代神經(jīng)細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒和原代神經(jīng)細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基：
| 原代神經(jīng)細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒 | 原代神經(jīng)細(xì)胞專用完全培養(yǎng)基 |
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大鼠皮層神經(jīng)元細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒(P-CA-604) 大鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒(P-CA-601) 大鼠腦微血管周細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒(P-CA-602) 大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒(P-CA-603) 大鼠神經(jīng)星形膠質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒(P-CA-605) 大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒(P-CA-606) 大鼠主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞分離培養(yǎng)試劑盒(P-CA-607) |
人神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(CM-H273) 神經(jīng)元細(xì)胞完全培養(yǎng)基NM(CM-ZY003) 兔神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(CM-Rb139) 神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基NSCM(CM-ZY004) 大鼠神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(CM-R139) 小鼠神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)基(CM-M139) 小鼠神經(jīng)小膠質(zhì)細(xì)胞完全培養(yǎng)基(CM-M110) |
參考文獻(xiàn)
[1] Tsujioka H， Yamashita T. Utilization of ethanolamine phosphate phospholyase as a unique astrocytic marker. Frontiers in Cellular Neuroscience. 2023 January 30; 17: 1097512.
[2] Kong Y， Cao L， Wang J， Zhuang J. In vivo reactive astrocyte imaging using [18F]SMBT-1 in tauopathy and familial Alzheimer's disease mouse models: A multi-tracer study. Journal of the Neurological Sciences. 2024 July 15; 462: 123079.
[3] Barclay WE， Aggarwal N， Deerhake ME. The AIM2 inflammasome is activated in astrocytes during the late phase of EAE. JCI Insight. 2022 April 22; 7 (8): e155563.
[4] Tsujioka H， Yamashita T. Utilization of ethanolamine phosphate phospholyase as a unique astrocytic marker. Frontiers in Cellular Neuroscience. 2023 January 30; 17: 1097512.
[5] Sidoryk-Wegrzynowicz M, Gerber YN, Ries M. Astrocytes in mouse models of tauopathies acquire early deficits and lose neurosupportive functions. Acta Neuropathologica Communications. 2017 Nov 29;5(1):89.
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[7] Pai B， Tome-Garcia J， Cheng WS. High-resolution transcriptomics informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. Acta Neuropathologica Communications. 2022 October 23; 10 (1): 149.
