文獻解讀 | 半小時內(nèi)區(qū)分5種實體瘤細胞的納米機器人

近年來，腫瘤標志物的主動靶向診療策略取得了極大的進步。然而，腫瘤標志物在腫瘤細胞中非排他性表達的現(xiàn)象常常導(dǎo)致診療試劑“在靶，非腫瘤”的脫靶問題，從而產(chǎn)生假陽性和毒副作用?；谶壿嬤\算識別腫瘤細胞表面多個疾病標志物的DNA納米機器，為腫瘤細胞的精準識別提供了一種有效工具。

然而，目前大多數(shù)DNA納米器件存在以下亟需解決的關(guān)鍵問題：

（1）難以滿足生理條件下原位操作要求。例如，37°C長時間孵育往往會導(dǎo)致DNA納米器件的非特異性內(nèi)化和泄漏。

（2）難以從三到四種相似的亞群或亞型細胞中實現(xiàn)單次輸入即識別目標細胞。

（3）難以實現(xiàn)“one cell one barcode”的診斷和針對目標細胞的協(xié)同殺傷。

鑒于此，湖南大學(xué)譚蔚泓院士課題組構(gòu)建了活細胞膜錨定的二階DNA邏輯門控納米機器人(DLGN)，同時實現(xiàn)多路診斷和靶細胞的協(xié)同殺滅。

該納米機器人能在半小時內(nèi)區(qū)分5種實體瘤細胞（或正常細胞），特別是乳腺癌的腫瘤進展情況，并在6h內(nèi)表現(xiàn)出明顯的靶向殺傷效果。該項研究成果被發(fā)表在《Angewandte Chemie International Edition》(IF=15.336)上。

設(shè)計的原理和特點

DLGN的分子設(shè)計和運行原理

(a) 基于多種適配體介導(dǎo)的感應(yīng)后釋放策略的一般分子設(shè)計，用于精確細胞鑒別和靶向殺傷表達不同標記物的不同細胞，通過DLGN的識別和釋放將會被相應(yīng)的熒光條形碼標記

(b) DLGN在靶細胞膜上執(zhí)行二階邏輯生物運算后產(chǎn)生的級聯(lián)生物事件

圖文數(shù)據(jù)

DLGN的構(gòu)建和表征

(a) AGE熒光凝膠電泳實驗證明SA標記的DLGN的成功組裝

(b) 四面體支架DTS和納米機器人DLGN的DLS粒徑分布

(c) SA修飾的DTS，膽固醇修飾的DTS和無標簽修飾的DTS對靶細胞MDA-MB-468和正常細胞MCF-10A的成像

該實驗發(fā)現(xiàn)SA-DTS不會內(nèi)化到細胞內(nèi)，只會依賴于適配體的識別“停泊”在細胞膜上，而chol-DTS和free-DTS則會出現(xiàn)非特異性的錨定和無選擇性的內(nèi)化。證明SA特殊修飾下的DNA納米機器人更適合做細胞表面的識別和生物計算。

流式儀檢測5種細胞系8個相應(yīng)適配體的細胞表面蛋白譜

(a) MCF-10A(正常乳腺細胞)、MCF-7(急性的乳腺癌細胞)、MDA-MB-468（轉(zhuǎn)移性的三陰性乳腺癌細胞）、Hela(宮頸癌細胞)和HepG2(肝癌細胞)在8種FAM修飾的核酸適配體孵育后的熒光強度熱圖

(b) 選取的三種生物標記物（和對應(yīng)的核酸適配體）在5種細胞系的表達情況

該實驗為DLGN的鏈設(shè)計提供具體的模型指導(dǎo), 即：兩個腳趾分別采用MUC1和EpCAM的適配體，效應(yīng)頭部擬用PTK7對應(yīng)的適配體Sgc8c。

在緩沖液中對DLGN “AND”布爾邏輯門運算的可行性測試

(a) DLGN在腳趾適配體的互補解碼鏈(cM*和cE*)的置換下引發(fā)的熒光恢復(fù)情況示意圖

(b)-(d) DLGN在解碼鏈孵育下的熒光測試譜圖

實驗表明當(dāng)兩個解碼鏈共同存在時才會觸發(fā)Cy5-EASDs的熒光恢復(fù)，證明了“AND”布爾邏輯門運算的可行性。

多路診斷識別五種細胞系和精確協(xié)同殺傷靶腫瘤細胞

(a)點擊化學(xué)下的協(xié)同藥物EASDs的合成

(b)標記物構(gòu)成的布爾邏輯門網(wǎng)絡(luò)驅(qū)動5種細胞的多通道成像和識別

(c)基于流式細胞術(shù)的五種細胞系相對熒光強度的熱圖分析（每個小格從左下往右上依次是MCF-10A, HeLa, HepG2, MCF-7, MDA-MB-468）。藍色表示沒有熒光輸出，紅色表示有熒光輸出。圓圈的面積表示相對的熒光值大小。實現(xiàn)表明每種細胞有相應(yīng)的條形碼輸出（右圖）

(d)不同藥物處理6h后，5種細胞的存活情況

該DLGN藥物僅靶細胞MDA-MB-468有殺傷毒性，而EASDs對PTK7高表達的Hela和HepG2的“旁觀者“細胞有細胞毒性。相比于單種藥物分子CA4-DLGN和PTX-DLGN, 多負載的DLGN具有對靶細胞更高的殺滅效果。

總結(jié)與展望

本研究構(gòu)建了一種智能DNA分子機器人，其只需要一次輸入這一種分子即可自主完成多種腫瘤細胞的分型，以及對某一特定腫瘤細胞的協(xié)同藥物殺傷。DLGN可以在半小時內(nèi)區(qū)分多種相似的細胞系，并在6小時內(nèi)的原位血清中殺死靶腫瘤細胞，消除靶抗原脫靶現(xiàn)象。

此外，通用的“感知然后釋放”策略也能夠功能化其他標記物 (如HER-2或EGFR) 到這個二階邏輯門控DNA納米機器人上。

可以想象，這種合理設(shè)計的DLGN納米機器人的腳趾、軀干, 手臂和頭部，能夠激發(fā)其他更智能的DNA納米機器人工程，以及在分子開關(guān)、多模式傳感器、可控的捕獲-釋放、精準的分子醫(yī)學(xué)和其他基礎(chǔ)研究和臨床測試方面的更廣泛應(yīng)用。

文獻所用普諾賽產(chǎn)品

產(chǎn)品名稱：7-AAD染色液

產(chǎn)品貨號：P-CA-162