細(xì)胞學(xué)堂 | LNCaP clone FGC細(xì)胞培養(yǎng)攻略
人前列腺癌細(xì)胞LNCaP Clone FGC，是1977年從一位50歲白人男性（血型B+）的左鎖骨淋巴結(jié)針刺活檢中分離的，當(dāng)時(shí)該患者已確診為轉(zhuǎn)移性前列腺癌。根據(jù)報(bào)道，該細(xì)胞對(duì)5-α-二氫睪酮（生長(zhǎng)調(diào)節(jié)并生成酸性磷酸酶ACP）有響應(yīng)。
那如何養(yǎng)好LNCaP Clone FGC 呢？普諾賽今天來(lái)為你們?cè)敿?xì)講解。
培養(yǎng)注意事項(xiàng)
1、該細(xì)胞并不形成一致的單層，而是形成集落；
2、該細(xì)胞會(huì)使培養(yǎng)基快速變酸，且生長(zhǎng)緩慢，故傳代后 48 小時(shí)內(nèi)不應(yīng)擾動(dòng)；
3、普通TC處理的培養(yǎng)瓶或皿不能使細(xì)胞很好的貼壁，培養(yǎng)難度較高，需使用 Corning 的 cellbind 細(xì)胞培養(yǎng)瓶（貨號(hào)是 3289），或者使用多聚-L-賴氨酸溶液（貨號(hào) PB180523）包被過(guò)的培養(yǎng)皿；
4、在細(xì)胞運(yùn)輸途中，多數(shù)細(xì)胞會(huì)從培養(yǎng)瓶底分離，大片懸浮在培養(yǎng)基中，按照收貨注意事項(xiàng)處理即可恢復(fù)正常。
▲ 正常生長(zhǎng)的LNCaP Clone FGC細(xì)胞
▲ 聚集生長(zhǎng)的LNCaP Clone FGC細(xì)胞
收貨處理方式
收貨后，如果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞漂浮或成團(tuán)，可按下面的步驟進(jìn)行處理：
1、將培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的所有培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管，離心收集細(xì)胞（1200rpm 3min）；
2、去掉上清，用PBS重懸細(xì)胞，將細(xì)胞收集到一個(gè)離心管中，PBS震動(dòng)離心管混勻即可，再次離心（1200rpm 3min）；
3、去掉上清，加入1ml左右0.25%胰酶，重懸混勻細(xì)胞。震動(dòng)離心管，混勻即可，不能吹打。放入培養(yǎng)箱，消化細(xì)胞，消化時(shí)間3分鐘左右；
4、消化完畢后，用移液槍輕輕吹打細(xì)胞懸液，使細(xì)胞團(tuán)分散。加入5ml含血清的培養(yǎng)基，混勻后終止消化，離心（1200rpm 3min）；
5、去掉上清，加入5-7ml相應(yīng)完全培養(yǎng)基混勻，輕輕/反復(fù)吹打細(xì)胞，接種于無(wú)菌T25瓶中（接種容器應(yīng)提前用對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基浸潤(rùn)）。
▲ LNCaP Clone FGC細(xì)胞到貨漂浮
▲ LNCaP Clone FGC細(xì)胞接種量少
傳代步驟
1、吸出原培養(yǎng)液；
2、加入2ml左右PBS，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，潤(rùn)洗細(xì)胞，吸出PBS，丟棄；
3、加入1ml左右胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使之浸潤(rùn)所有細(xì)胞；
4、放入培養(yǎng)箱消化，消化5分鐘左右，顯微鏡下可看到，細(xì)胞塊中間的細(xì)胞明顯分離變圓，且自然脫落（全程不要拍打培養(yǎng)瓶）；
5、加入3ml含血清的培養(yǎng)基，終止消化，輕輕/反復(fù)吹打細(xì)胞，在顯微鏡下觀察。細(xì)胞懸液中，細(xì)胞盡量為單個(gè)狀態(tài)；
6、收集細(xì)胞懸液，離心（1200rpm 3min）。離心完，吸出上清，丟棄；
7、加入新鮮培養(yǎng)基，吹打幾下，混勻細(xì)胞即可。按需接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)充足量培養(yǎng)基，擰松瓶蓋，或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng)；
8、檢查培養(yǎng)箱的二氧化碳、溫度及水盤。
傳代比例和頻次
推薦1:2~1:4傳代，每4~5天傳代一次。
換液步驟
吸出舊培養(yǎng)基，沿培養(yǎng)瓶側(cè)邊加入新培養(yǎng)基；
每3天換液一次。
凍存步驟
1、配置凍存液。推薦配比：55%（基礎(chǔ)培養(yǎng)基1640）+40%(血清)+5%（DMSO）；
2、DMSO配置時(shí)會(huì)放熱，一定要等凍存液冷卻后再使用，避免灼傷細(xì)胞；
3、細(xì)胞消化好后用新鮮培養(yǎng)基中止，制成細(xì)胞懸液；
4、1200rpm 3min 離心后去上清，盡量吸干凈上清；
5、加入配置好的凍存液，重懸，建議一個(gè)T25長(zhǎng)滿凍存1支，或者細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照2-5×106cells/支的比例凍存；
6、將分裝好的凍存液轉(zhuǎn)入程序凍存盒，放入-80℃冰箱過(guò)夜；
7、從-80℃冰箱取出凍存管，迅速轉(zhuǎn)移到液氮，長(zhǎng)期保存。
復(fù)蘇步驟
1、將水浴鍋預(yù)熱至37℃，準(zhǔn)備好干凈的一次性手套，向一個(gè)無(wú)菌離心管內(nèi)，加入9ml無(wú)菌培養(yǎng)基；
2、將LNCaP Clone FGC細(xì)胞從液氮罐中取出，放入一次性手套中，迅速?zèng)]入水浴鍋。搖晃凍存管加速溶解，以1分鐘內(nèi)全部溶解為宜；
3、在超凈臺(tái)中，將復(fù)蘇好的細(xì)胞液，加入到裝有新鮮培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，1200rpm/min離心3分鐘，離心完畢，去掉上清；
4、用適量與細(xì)胞對(duì)應(yīng)的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接入到無(wú)菌容器（培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿）中，補(bǔ)充一定量培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
5、溶解過(guò)程要迅速，已溶解的凍存細(xì)胞不能在常溫下存放太久，需盡快離心去除DMSO。
參考文獻(xiàn)：
[1].https://www.cellbank.org.cn/cellbank_upload/20191204161104_6905.pdf
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