細(xì)胞學(xué)堂 | 有限傳代細(xì)胞代次管理秘籍

本期將主講有限傳代細(xì)胞，及其代次管理方法?？靵聿槭瞻?！

如有疑惑，請(qǐng)?jiān)谖哪┝粞浴?/p>

常見的有限傳代細(xì)胞

有限傳代細(xì)胞屬于二倍體細(xì)胞，它的核型相對(duì)穩(wěn)定，與生物體細(xì)胞特性更加相似，其對(duì)代次要求也更高。因有限傳代細(xì)胞的分裂存在一個(gè)極限，所以在達(dá)到該極限值后，細(xì)胞將不再繼續(xù)分裂，并會(huì)導(dǎo)致衰老、死亡，不能進(jìn)行無限增殖。

常見有限傳代細(xì)胞如表1所示：

表1. 常見有限傳代細(xì)胞

注意：

有限傳代細(xì)胞應(yīng)在細(xì)胞理論代次前2/3使用（如MRC-5，一般40代前狀態(tài)較好）。

為什么細(xì)胞有傳代限制

1965年，微生物學(xué)家Leonard Hayflick提出海夫利克極限，該實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了人體細(xì)胞分裂次數(shù)上限為“56”， 被認(rèn)為是機(jī)體衰老的原因。

1975年，Elizabeth H.Blackburn等人發(fā)現(xiàn)端粒，其由簡(jiǎn)單的DNA高度重復(fù)序列組成，保證每條染色體的完整性，而端粒的長(zhǎng)度反映了細(xì)胞復(fù)制史及復(fù)制潛能。

正是因?yàn)槎肆Ｏ拗浦?xì)胞分裂次數(shù)，所以傳代培養(yǎng)的細(xì)胞有了傳代限制。同時(shí)，對(duì)于不同物種細(xì)胞體外培養(yǎng)代次也有所不同，如表2所示。

表2. 體外培養(yǎng)的胚胎成纖維細(xì)胞的平均培養(yǎng)代數(shù)

以上就是有限傳代細(xì)胞的基本信息。接下來，我們講一下它的代次管理！

為什么要進(jìn)行代次管理

細(xì)胞狀態(tài)

有限傳代細(xì)胞會(huì)衰老，其細(xì)胞形態(tài)特征和生長(zhǎng)速度等會(huì)發(fā)生變化。

 遺傳特性

有限傳代細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增多，在傳代過程易產(chǎn)生遺傳漂變，基因/蛋白表達(dá)發(fā)生變化。

細(xì)胞庫管理

細(xì)胞庫管理屬于細(xì)胞庫分級(jí)管理標(biāo)準(zhǔn)之一，而代次管理屬于細(xì)胞庫管理內(nèi)容之一。

代次計(jì)算

對(duì)于有限傳代細(xì)胞代次的計(jì)算，我們可以采用記錄細(xì)胞群體倍增數(shù)（PDL）的方法。

公式如下：

PDL =X+3.322(log Y – log I)

X為傳代前代次，I 為細(xì)胞接種前細(xì)胞數(shù)，Y 為培養(yǎng)后細(xì)胞總數(shù)。

注意：

1. 常規(guī)培養(yǎng)時(shí)，1:2傳代代次+1，1:3傳代代次+1.5；

2. 擴(kuò)增培養(yǎng)記錄接種細(xì)胞量以及收獲細(xì)胞量，根據(jù)公式計(jì)算代次。

細(xì)胞代次管理

細(xì)胞的代次管理，共有以下三個(gè)步驟：

細(xì)胞引進(jìn)

當(dāng)我們得到一個(gè)新的細(xì)胞，就要記錄該細(xì)胞的初始代次。

擴(kuò)增培養(yǎng)

對(duì)細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)時(shí)，可以根據(jù)傳代過程記錄代次。

分級(jí)凍存

在進(jìn)行細(xì)胞凍存時(shí)，可以根據(jù)不同級(jí)別凍存庫，對(duì)細(xì)胞代次進(jìn)行控制。

注意：

1. 常規(guī)培養(yǎng)時(shí)按照1:2傳代，記錄每次傳代后代次；

2. 凍存細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞數(shù)量計(jì)算細(xì)胞代次，最后凍存的批次進(jìn)行傳代數(shù)檢測(cè)。

有限傳代細(xì)胞傳代測(cè)試

在進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇后，以一定密度接種至孔板培養(yǎng)，每次密度達(dá)到80%傳代，需記錄傳代次數(shù)及傳代間隔。（要求：在預(yù)計(jì)傳代次數(shù)內(nèi)，細(xì)胞形態(tài)無明顯差異，傳代時(shí)機(jī)間隔無明顯變化。）

如測(cè)試后未達(dá)到預(yù)期傳代數(shù)，可進(jìn)行細(xì)胞衰老檢測(cè)。

細(xì)胞衰老檢測(cè)方法

在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，我們常用到細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶檢測(cè)試劑盒。細(xì)胞在PH值為6時(shí)，β-半乳糖苷酶陽性率隨代齡增加而逐漸上調(diào)。衰老細(xì)胞/組織產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以催化底物X-Gal生成藍(lán)色產(chǎn)物（如下圖所示）。

圖3. 細(xì)胞染色效果圖

注意：

限制庫存的有限傳代細(xì)胞系代次以保證庫存細(xì)胞質(zhì)量，達(dá)到一定代次后，細(xì)胞自身的狀態(tài)都會(huì)開始不斷變差，不符合實(shí)驗(yàn)要求。用有限傳代細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)時(shí)需要做好使用規(guī)劃和代次管理，確保實(shí)驗(yàn)的正常使用。

溫馨提醒：

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