細(xì)胞學(xué)堂 | HMC3人小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)從零開始

培養(yǎng)條件

培養(yǎng)液：MEM(含NEAA)＋10% FBS＋1% P/S

二氧化碳培養(yǎng)箱：穩(wěn)定的溫度（37℃），穩(wěn)定的CO₂水平（5%）

生長特性

貼壁，巨噬細(xì)胞樣

傳代比例和頻次

推薦1:3~1:5傳代，每3~4天傳代一次

細(xì)胞類型

小膠質(zhì)細(xì)胞

形態(tài)學(xué)

巨噬細(xì)胞

背景介紹

HMC3細(xì)胞系，是通過人胎腦源性原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物的 SV40 依賴性永生化建立的，靜息 HMC3 細(xì)胞的小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞標(biāo)志物IBA1呈強(qiáng)陽性，星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物GFAP呈陰性。

活化小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物，即MHCII、CD68 和 CD11b，在靜息 HMC3 細(xì)胞中呈陰性，但在被 IFN-γ（10ng/mL，24 小時(shí)）激活后上調(diào)。

具體應(yīng)用

神經(jīng)科學(xué)，神經(jīng)炎癥

轉(zhuǎn)化的人小膠質(zhì)細(xì)胞代表可以無限生長的同質(zhì)細(xì)胞群，并且可以用于小膠質(zhì)細(xì)胞功能的生化分析的便捷系統(tǒng)。正如實(shí)驗(yàn)所證明的，它們還可以進(jìn)行轉(zhuǎn)染，這對(duì)研究小膠質(zhì)細(xì)胞中各種轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)調(diào)控有重要意義。

培養(yǎng)注意事項(xiàng)

1、2-3天換液一次；

2、培養(yǎng)過程中可能會(huì)有細(xì)胞碎片產(chǎn)生，及時(shí)換液除去即可。

傳代步驟

1、吸出原培養(yǎng)液；

2、加入2mL左右PBS，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤洗細(xì)胞，吸出PBS丟棄；

3、加入1mL左右胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶，使之浸潤所有細(xì)胞；

4、放入培養(yǎng)箱消化，消化2-3分鐘，輕拍培養(yǎng)瓶側(cè)壁，顯微鏡下看到細(xì)胞脫壁且聚集的細(xì)胞團(tuán)松散開后，可終止；

5、加入3mL含血清的培養(yǎng)基，終止消化，吹打細(xì)胞使之脫壁，并在液體里反復(fù)吹打，使細(xì)胞混勻?yàn)閼腋∫?，這時(shí)可以在顯微鏡觀察；

6、收集細(xì)胞懸液離心，1200rpm/min 3分鐘，離心完吸出上清丟棄；

7、加入新鮮培養(yǎng)基，吹打幾下混勻細(xì)胞即可；按需接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng)；

8、檢查培養(yǎng)箱二氧化碳、溫度和水盤。

換液步驟

1、吸出舊培養(yǎng)基，用PBS進(jìn)行潤洗，然后加入新的培養(yǎng)基；

2、每2~3天換液一次。

凍存步驟

1、配制凍存液，凍存液推薦配比：55%（基礎(chǔ)培養(yǎng)基DM/F12）+40%(血清)+5%（DMSO）；

2、DMSO配制的時(shí)候會(huì)發(fā)熱，一定要等凍存液冷卻后使用，避免灼傷細(xì)胞；

3、細(xì)胞消化下來制成細(xì)胞懸液；

4、1200rpm 3分鐘離心后去上清，盡量吸干凈上清；

5、加入配制好的凍存液重懸，建議一個(gè)T25長滿，凍存1支，或者細(xì)胞計(jì)數(shù)后，按照3~5×106cells/支凍存；

6、分裝好的凍存液轉(zhuǎn)入程序凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；

7、從-80℃冰箱取出凍存管，并迅速轉(zhuǎn)移到液氮長期保存。

復(fù)蘇步驟

1、將水浴鍋預(yù)熱至37℃，準(zhǔn)備好干凈的一次性PE手套，向一個(gè)無菌離心管內(nèi)加入5mL無菌培養(yǎng)基；

2、將細(xì)胞從液氮罐中取出，放入PE手套中，迅速?zèng)]入水浴鍋，搖晃凍存管，使細(xì)胞快速溶解，以1分鐘內(nèi)全部溶解為宜；

3、在超凈臺(tái)中，將復(fù)蘇好的細(xì)胞液加入到裝有新鮮培養(yǎng)基的離心管內(nèi)，1200rpm/min離心3分鐘，離心完畢去掉上清；

4、取適量專用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接入到無菌容器中（培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿），補(bǔ)充培養(yǎng)基到適宜，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

5、溶解過程要快，已溶解的凍存細(xì)胞在常溫中盡量短時(shí)間存放，盡快離心去除DMSO。

圖1. HMC3細(xì)胞正常生長

參考文獻(xiàn)

[1] Nakagawa Y, Chiba K. Diversity and plasticity of microglial cells in psychiatric and neurological disorders. Pharmacol Thera 154: 21–35, 2015. PubMed: 26129625

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[3] Li B, et al. NOX4 expression in human microglia leads to constitutive generation of reactive oxygen species and to constitutive IL-6 expression. J Innate Immun 1(6): 570–581, 2009. PubMed: 20375612

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