一文了解細(xì)胞爬片制作全過(guò)程

細(xì)胞爬片是一種將細(xì)胞培養(yǎng)在玻璃或塑料表面上，使其附著并擴(kuò)展的技術(shù)。一般是讓玻片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)，使細(xì)胞在玻片上生長(zhǎng)。這種技術(shù)可以用于觀察細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞與細(xì)胞之間相互作用等。利用細(xì)胞爬片進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)可排除體內(nèi)諸多干擾因素的影響，方便對(duì)細(xì)胞進(jìn)行各種干預(yù)處理。

我們?cè)谧雒庖邿晒猓↖F）、原位雜交（FISH）、凋亡檢測(cè)（TUNEL）等實(shí)驗(yàn)時(shí)，都需要制備細(xì)胞爬片，而爬片質(zhì)量會(huì)影響到最后的圖片呈現(xiàn)效果以及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的精準(zhǔn)性。本期細(xì)胞學(xué)堂為大家整理了細(xì)胞爬片的制作步驟及注意事項(xiàng)，幫助您快速上手開(kāi)展實(shí)驗(yàn)。

操作步驟

1、爬片準(zhǔn)備

(1) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)選擇合適大小的爬片。

(2) 爬片處理，首先浸酸：5%稀鹽酸浸泡過(guò)夜（最好逐片浸入，多片同時(shí)浸入會(huì)引起多片粘連、浸洗不充分），第二天先用自來(lái)水沖洗20次，再用三蒸水沖洗2次（清除殘留酸液）。

(3) 將爬片置于無(wú)水乙醇浸泡過(guò)夜（浸洗脂類污漬），75%乙醇長(zhǎng)期保存?zhèn)溆茫o(wú)需高壓滅菌）。使用時(shí)鑷子取出爬片，酒精燈烘烤，放入孔板。

2、細(xì)胞爬片

(1) 收集貼壁細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，按照實(shí)驗(yàn)需求用完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至合適濃度。

(2) 加細(xì)胞前，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴加少量培養(yǎng)基（目的是使爬片與培養(yǎng)皿靠液體的張力粘合到一起），然后輕放爬片（注意不要產(chǎn)生氣泡，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起）。整個(gè)過(guò)程注意無(wú)菌操作。

(3) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求接種合適細(xì)胞量到培養(yǎng)器皿內(nèi)。

3、爬片的固定

(1) 固定液的選擇：

     a. 多聚甲醛（常用4%）：可用于免疫電鏡、免疫組化、免疫熒光以及TUNEL染色等。室溫固定15~30 min后可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

     b. 4%中性甲醛：又名“10%中性福爾馬林”，應(yīng)用廣泛，常用于免疫組化、免疫熒光以及TUNEL染色等。形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強(qiáng)，但甲醛放置過(guò)久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露，可能造成假陰性的染色結(jié)果。室溫固定15~30 min后可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

     c. 其他：如冷丙酮、75%~95%乙醇等，具體的以實(shí)驗(yàn)要求為準(zhǔn)。

(2) 以多聚甲醛為例進(jìn)行固定：

     a. 準(zhǔn)備4%多聚甲醛（PFA），于4℃冰箱中保存，使用時(shí)常溫復(fù)溫。

     b. 在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的爬片用PBS浸洗3次，每次3 min，輕輕晃動(dòng)，避免將細(xì)胞沖掉。

     c. 用4%的多聚甲醛固定爬片15 min（細(xì)胞自帶熒光時(shí)注意避光），PBS浸洗爬片3次，每次3 min。

     d. Triton X-100（PBS配制，濃度根據(jù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整）室溫通透20 min。

     e. PBS浸洗爬片3次，每次3 min。

     f. 按實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

4、細(xì)胞爬片封片

封片前根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求決定是否需要孵育抗體或復(fù)染核。孵育好后用PBS浸洗3次，用吸水紙吸干爬片上的液體，封片液封片。

注意事項(xiàng)

固定好的細(xì)胞爬片建議盡快用于實(shí)驗(yàn)，以免影響實(shí)驗(yàn)效果。

取爬片時(shí)注意控制力度，夾取時(shí)盡量夾取爬片邊緣，以免夾破爬片或造成劃痕。

細(xì)胞爬片取出后，一般用PBS潤(rùn)洗3遍（潤(rùn)洗操作盡量輕柔，以免細(xì)胞脫壁；根據(jù)研究目的，可調(diào)整潤(rùn)洗次數(shù)，避免細(xì)胞脫壁），然后做固定。

對(duì)于貼壁性較差的細(xì)胞，可提前用包被液（明膠，多聚賴氨酸，鼠尾膠原等）包被爬片。

如果細(xì)胞帶有熒光標(biāo)記，所有操作步驟盡量在較暗處進(jìn)行。

常見(jiàn)孔板細(xì)胞爬片（圓形）大小參考：