細(xì)胞學(xué)堂 | C2C12細(xì)胞培養(yǎng)攻略,C2C12細(xì)胞誘導(dǎo)分化步驟

C2C12 (小鼠成肌細(xì)胞)是由D·Yaffe和O·Saxel建立的小鼠成肌細(xì)胞株的亞克隆。C2C12細(xì)胞分化很快，容易形成可伸縮的肌管并生成特征性的肌蛋白。用骨形成蛋白2(BMP-2)處理C2C12細(xì)胞，會導(dǎo)致C2C12細(xì)胞的分化途徑從成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)換為成骨細(xì)胞。

C2C12作為研究肌肉理想的細(xì)胞模型，在實驗研究中常誘導(dǎo)其分化為多核肌管。成肌分化在肌肉再生中起重要作用，它是通過一種高度協(xié)調(diào)的序列程序來產(chǎn)生成熟的骨骼肌的過程。

基礎(chǔ)信息

生長特性：貼壁細(xì)胞

細(xì)胞形態(tài)：成肌細(xì)胞樣

生長培養(yǎng)基：DMEM＋10% FBS＋1% P/S

推薦傳代比例：1:3-1:4

推薦換液頻率：2~3次/周

倍增時間：~20小時

凍存條件：   

凍存液：55% 基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO

溫度：液氮

培養(yǎng)條件：   

氣相：空氣，95%；CO2，5%

溫度：37℃

圖1. C2C12細(xì)胞正常生長

C2C12細(xì)胞狀態(tài)直接影響著分化潛力，要想細(xì)胞分化做得好，首先要在培養(yǎng)上下功夫。該細(xì)胞的換液和傳代步驟，參照其他貼壁細(xì)胞進(jìn)行操作即可。除此之外，還有以下三點，需要留意：

1、該細(xì)胞生長速度快，容易分化，建議密度達(dá)70%時傳代；

2、不要讓細(xì)胞長得太滿甚至開始融合，影響后續(xù)成肌分化率；

3、細(xì)胞消化完全后再吹打混勻，不要用槍頭把沒有消化好的細(xì)胞吹下來，以免細(xì)胞成團。

待C2C12細(xì)胞生長至匯合度為80%左右時，即可進(jìn)行誘導(dǎo)分化。具體步驟如下:

1、丟棄舊培養(yǎng)基，用PBS清洗兩次；

2、換分化培養(yǎng)基（高糖DMEM+2%~6%馬血清+1% P/S）誘導(dǎo)，然后置于CO2恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；

備注：由于馬血清品質(zhì)不同，建議馬血清做2%、4%、6%梯度測試，以確定最佳濃度。

3、每24h換液一次，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和生長狀況。誘導(dǎo)分化成功時，可以看見肌管表現(xiàn)為厚的管狀結(jié)構(gòu)，有時為多核。

圖2. C2C12細(xì)胞分化

小貼士

■ C2C12細(xì)胞代數(shù)不要太高；

■ 若加入分化培養(yǎng)基后，細(xì)胞仍然繼續(xù)生長，可用吉姆薩染色驗證是否有分化了的肌纖維；

■ C2C12細(xì)胞成肌分化過程中會有少量細(xì)胞凋亡，屬于正?，F(xiàn)象。

參考文獻(xiàn)

[1]張琳. EPA和DHA對C2C12成肌細(xì)胞增殖,分化和凋亡的影響[D]. 武漢輕工大學(xué), 2018.