細(xì)胞學(xué)堂 | 原代細(xì)胞和RAW 264.7誘導(dǎo)破骨細(xì)胞攻略！

骨骼系統(tǒng)為支撐身體、協(xié)調(diào)軀體運(yùn)動(dòng)、控制礦物質(zhì)穩(wěn)態(tài)和造血提供了重要的基礎(chǔ)。破骨細(xì)胞是由單核/巨噬細(xì)胞造血譜系前體細(xì)胞融合而成的特化細(xì)胞，在骨穩(wěn)態(tài)和健康維持中至關(guān)重要。已有大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)其細(xì)胞形成和功能失調(diào)與骨質(zhì)疏松癥、骨折愈合、骨關(guān)節(jié)炎和原發(fā)性/轉(zhuǎn)移性骨腫瘤等密切相關(guān)。一直以來，破骨細(xì)胞作為“噬骨者（bone eaters）”，被聚焦于探討其在骨穩(wěn)態(tài)和疾病中的角色。

破骨細(xì)胞為終末分化細(xì)胞，不能傳代，光鏡下可觀察到破骨細(xì)胞胞體較大、多核、有偽足和突起等特征。

圖1. 破骨細(xì)胞形態(tài)

在實(shí)驗(yàn)研究中，常通過誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)作用使體外培養(yǎng)的干細(xì)胞或單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，從而獲得破骨細(xì)胞。此方法獲得的是破骨樣細(xì)胞，破骨樣細(xì)胞是指原代或經(jīng)誘導(dǎo)而來具有破骨細(xì)胞特性的細(xì)胞，近年來廣泛用于破骨細(xì)胞的研究。誘導(dǎo)法可獲得的細(xì)胞純度高、數(shù)量大，可滿足各種生化和分生實(shí)驗(yàn)。常見的破骨誘導(dǎo)方法有2種：

原代細(xì)胞誘導(dǎo)

提取原代細(xì)胞，用巨噬細(xì)胞集落刺激因子( M-CSF），和核因子KB 受體活化因子配體( RANKL )誘導(dǎo)。

可使用25μg/L M-CSF+50μg/L RANKL的α-MEM完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)，隔3天換液一次，培養(yǎng)至第5天開始出現(xiàn)體積較大的破骨細(xì)胞。

目前發(fā)現(xiàn)的可誘導(dǎo)分化為破骨細(xì)胞的細(xì)胞系常見的是小鼠RAW 264. 7細(xì)胞系，下面我們以這個(gè)細(xì)胞為例介紹一下它的誘導(dǎo)方法。

RAW 264.7誘導(dǎo)

誘導(dǎo)試劑：可以用LPS誘導(dǎo)，RANKL誘導(dǎo)，或者M(jìn)-CSF+ RANKL誘導(dǎo)。

1. LPS誘導(dǎo)：10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL、100ng/mL LPS均能誘導(dǎo)，但30、50、100ng/mL LPS誘導(dǎo)的多核細(xì)胞數(shù)量更多，且30ng/mL LPS誘導(dǎo)的多核細(xì)胞大小明顯增加。

圖2. 不同濃度LPS誘導(dǎo)破骨

2. RANKL誘導(dǎo)：用含100μg/L RANKL的α-MEM完全培養(yǎng)基誘導(dǎo)，隔天換液一次，誘導(dǎo)培養(yǎng)至第4~5天出現(xiàn)大量多核細(xì)胞。

3. M-CSF+ RANKL誘導(dǎo): 使用100 ng /mL RANKL 與 100 ng /mL M-CSF的DMEM完全培養(yǎng)基，每?jī)商旄屡囵B(yǎng)液一次，第4天左右開始出現(xiàn)破骨細(xì)胞。

抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色

TRAP主要反映了破骨細(xì)胞的活性及骨吸收能力，是破骨細(xì)胞的良好標(biāo)志物,也是最常用的鑒定方法。待誘導(dǎo)出破骨細(xì)胞，可根據(jù)以下步驟進(jìn)行鑒定。

TRAP染色步驟: 2.5%戊二醛固定細(xì)胞10 min，蒸餾水充分沖洗，用TRAP染液處理50 min，蒸餾水充分沖洗后甘油封片。陽性染色細(xì)胞呈紅色，定位于胞漿, 陰性染色細(xì)胞呈黃色。

圖3. 破骨細(xì)胞經(jīng)TRAP染色

注意事項(xiàng)

原代細(xì)胞誘導(dǎo)形成的成熟破骨細(xì)胞數(shù)量及純度有限，但骨吸收活性強(qiáng)；RAW264.7細(xì)胞系誘導(dǎo)產(chǎn)生的破骨細(xì)胞數(shù)量多純度高，但吸收活性弱；

如果培養(yǎng)時(shí)，鏡下較多細(xì)胞出現(xiàn)偽足時(shí)，細(xì)胞整體狀態(tài)可能不好，這時(shí)的細(xì)胞不適合用于誘導(dǎo)破骨；

RAW264.7細(xì)胞的傳代次數(shù)對(duì)其能否誘導(dǎo)成破骨細(xì)胞至關(guān)重要，代數(shù)越低，細(xì)胞的分化能力越高；

原代細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)形成的破骨細(xì)胞周期長(zhǎng)，一般在9-10天時(shí)才達(dá)到最佳狀態(tài)；RAW 264.7誘導(dǎo)培養(yǎng)的周期稍短，一般在第5~6天時(shí)出現(xiàn)大量破骨細(xì)胞；

除了TRAP染色鑒定破骨細(xì)胞，通過觀察細(xì)胞核的數(shù)量以及降鈣素受體染色和觀察骨（牙）片吸收陷窩，可以進(jìn)一步鑒定破骨細(xì)胞是否具有骨吸收能力。

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