細胞學堂 | 貼壁細胞和懸浮細胞的凍存操作步驟及注意事項

當我們需要運輸或者長期不用某種細胞時，通常會使用凍存的方法來保存。若未做好細胞凍存，還會直接影響后續(xù)細胞復蘇狀態(tài)，所以細胞凍存的重要性不容小覷。

本期普諾賽細胞學堂將帶來貼壁細胞和懸浮細胞的凍存操作步驟及注意事項，以便大家查漏補缺。

在進行凍存操作前，可預先配置好凍存液；若使用無血清非程序凍存液，則無需自己配制，也無需使用程序降溫盒。

一、貼壁細胞凍存操作

◆ 將待操作的細胞去上清，用PBS潤洗；

◆ 去上清，加入胰酶消化，消化完成后加入完全培養(yǎng)基終止消化，并吹打均勻制備成細胞懸液；

◆ 1200rpm（250g）3min離心后盡量吸干凈上清，收集細胞沉淀；

◆ 加入配置好的凍存液重懸，一個T25培養(yǎng)瓶長到80%左右密度的細胞量可凍存1支，或者細胞計數(shù)后，按照3~5×106cells/支凍存，凍存液用量推薦0.5~1mL/支；

◆ 分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標記；

◆ 將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過夜；

◆ 最后將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。

二、懸浮細胞凍存操作

? 直接將細胞懸液于1200rpm（約250g）3分鐘離心后盡量吸干凈上清，收集細胞沉淀；

? 去上清，用配置好的凍存液重懸細胞，一個T25培養(yǎng)瓶長到傳代密度時的細胞量可凍存1支，或者細胞計數(shù)后，按照3~5×106cells/支凍存，凍存液用量推薦0.5~1mL/支；

? 分裝完畢后，擰緊凍存管蓋并做好標記；

? 將分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒，放入-80℃冰箱過夜；

? 再轉(zhuǎn)移至液氮長期保存。

注意事項

1、細胞凍存液需提前配制，不可直接將DMSO加入細胞懸液中；

2、應選擇匯合度80%-90%左右，處于對數(shù)生長期時的細胞進行凍存操作，確保細胞凍存時狀態(tài)最佳，凍存密度可根據(jù)細胞特性進行調(diào)整；

3、程序凍存盒、細胞凍存液、完全培養(yǎng)基等試劑都要復溫至室溫備用；

4、凍存前注意切勿消化時間過長、吹打力度過重、離心轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長，以免造成細胞損傷；

5、凍存細胞長期保存應放置于液氮，不建議在-80℃長期保存；

6、若沒有程序降溫盒，則按下列順序依次降溫：室溫→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃過夜→液氮保存，注意轉(zhuǎn)移過程中要保冷，避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化。