一次吃透MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞的成骨誘導(dǎo)

MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞是從MC3T3-E1細(xì)胞系中分離出的亞克隆之一，在含抗壞血酸和3~4 mM無機(jī)磷酸鹽培養(yǎng)基中生長表現(xiàn)出高水平的成骨細(xì)胞分化。MC3T3-E1 Subclone 24和MC3T3-E1 Subclone 30在含抗壞血酸培養(yǎng)基中生長表現(xiàn)出很差的成骨細(xì)胞分化，不形成ECM，可以作為MC3T3-E1 Subclone 14的陰性對(duì)照。

本期，我們將為大家?guī)鞰C3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞基本信息、成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)步驟及注意事項(xiàng)，幫助您輕松掌握實(shí)驗(yàn)技巧，確保實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。

注：此次MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)是普諾賽內(nèi)部測(cè)試數(shù)據(jù)，僅供參考。

MC3T3-E1 Subclone 14（細(xì)胞基本信息）

生長特性：貼壁細(xì)胞

細(xì)胞形態(tài)：成纖維細(xì)胞樣

推薦傳代比例：1:3~1:4

推薦換液頻率：2~3次/周

生長培養(yǎng)基：MEMα＋10% FBS＋1% P/S

凍存條件：凍存液：55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO

                  溫度：液氮

培養(yǎng)條件：氣相：空氣，95%；CO2，5%

                  溫度：37℃

MC3T3-E1 Subclone 14（細(xì)胞成骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)步驟）

（以12孔板為例）

選用普諾賽MC3T3-E1 Subclone 14（小鼠顱頂前骨細(xì)胞亞克隆14）細(xì)胞。

1、MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞正常培養(yǎng)，細(xì)胞融合度達(dá)到80%~90%時(shí)，即可用胰酶消化，計(jì)數(shù)；

2、按2~3×104 cells/cm2的細(xì)胞密度接種在12孔板中（具體接板數(shù)量以實(shí)際預(yù)實(shí)驗(yàn)情況為準(zhǔn)），每孔加入1 mL的MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞完全培養(yǎng)基；

3、將接種好的MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞置于37℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；

4、誘導(dǎo)試劑配置：MC3T3-E1 Subclone 14成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清和添加物三部分組成，使用前將各組分混勻后即可得到成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基；

5、當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%~95%時(shí)，小心的將孔內(nèi)完全培養(yǎng)基吸走，向12孔板中加入1 mL預(yù)熱的MC3T3-E1 Subclone 14成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基；

6、每隔48~72h更換預(yù)熱的新鮮的成骨誘導(dǎo)分化完全培養(yǎng)基；

7、誘導(dǎo)培養(yǎng)2~4周，期間注意觀察細(xì)胞形態(tài)變化。根據(jù)細(xì)胞鈣質(zhì)結(jié)節(jié)形成的情況，決定是否進(jìn)行下一步染色鑒定。

（詳細(xì)操作步驟可參考MC3T3-E1 Subclone 14成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基產(chǎn)品說明書）

誘導(dǎo)分化結(jié)果展示

MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞誘導(dǎo)前，細(xì)胞融合度95%左右，誘導(dǎo)前細(xì)胞圖：

誘導(dǎo)前，白光圖

用MC3T3-E1 Subclone 14成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)第15天，未染色和茜素紅染色后細(xì)胞圖：

誘導(dǎo)第15天，染色前

誘導(dǎo)第15天，茜素紅染色

如果想增加鈣結(jié)節(jié)的形成量，可適當(dāng)延長誘導(dǎo)時(shí)間。

用MC3T3-E1 Subclone 14成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)第20天，未染色和茜素紅染色后細(xì)胞圖：

誘導(dǎo)第20天，染色前

誘導(dǎo)第20天，茜素紅染色

誘導(dǎo)過程中注意事項(xiàng)

1、開始誘導(dǎo)時(shí)的細(xì)胞密度可控制在90%~95%，注意避免細(xì)胞過飽和導(dǎo)致細(xì)胞卷邊漂起或者狀態(tài)不佳。

2、實(shí)驗(yàn)開始前確保細(xì)胞狀態(tài)，盡可能使用早代次的細(xì)胞開始實(shí)驗(yàn)。

3、細(xì)胞鋪板需均勻，鋪板不均勻可能導(dǎo)致分化不均勻、分化比例低、分化過程中細(xì)胞漂浮等問題。

4、由于誘導(dǎo)時(shí)間較長，為防止細(xì)胞脫落，可提前使用明膠包被培養(yǎng)板。

5、細(xì)胞換液或者添加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基時(shí)需注意：誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基提前37℃復(fù)溫；換液時(shí)可留一點(diǎn)原液作為緩沖，加液時(shí)槍頭沿壁逐滴加入，操作應(yīng)迅速，盡量避免在超凈臺(tái)內(nèi)操作時(shí)間過長，同時(shí)手法要輕柔；這樣對(duì)細(xì)胞的沖擊最小，否則極易導(dǎo)致細(xì)胞卷邊飄起。

6、避免長時(shí)間將細(xì)胞拿出培養(yǎng)箱外進(jìn)行觀察，并盡量減少培養(yǎng)板的晃動(dòng)，以防細(xì)胞卷邊或漂浮。

7、拍照時(shí)可留少量PBS，減少光圈的出現(xiàn)，以便呈現(xiàn)更好的拍攝效果。

以上是關(guān)于MC3T3-E1 Subclone 14細(xì)胞成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的步驟、誘導(dǎo)分化圖片參考及相關(guān)注意事項(xiàng)，更多細(xì)胞培養(yǎng)干貨，請(qǐng)持續(xù)關(guān)注細(xì)胞學(xué)堂專欄~