細(xì)胞學(xué)堂 | 原代細(xì)胞的取材方法

人和動(dòng)物體內(nèi)絕大部分組織都可以在體外培養(yǎng)，但其難易程度與組織類型、分化程度、供體的年齡、原代培養(yǎng)方法等有直接關(guān)系。原代取材是進(jìn)行組織細(xì)胞培養(yǎng)的第一步，也是非常關(guān)鍵的一步，將直接影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)的正常進(jìn)行。本期細(xì)胞學(xué)堂將詳述取材基本要求及各類組織取材方法。

取材基本要求

• 取材的組織盡量在4~6h內(nèi)制作成細(xì)胞。若不能及時(shí)培養(yǎng)，可將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi)，放置于冰浴或4℃冰箱中。如果組織塊很大，應(yīng)先將其切成1cm3以下的小塊再低溫保存，但時(shí)間不能超過24h。

• 取材時(shí)應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌操作，用無(wú)菌包裝的器皿或用事先消毒好的、帶少許培養(yǎng)液（內(nèi)含青、鏈霉素）的小瓶等便于攜帶的物品取材。

• 取材和原代培養(yǎng)時(shí)，要用鋒利的器械如手術(shù)刀切碎組織，盡可能減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷。

• 對(duì)于組織樣本帶有的血液、脂肪、神經(jīng)組織、結(jié)締組織和壞死組織，取材時(shí)要細(xì)心除去；分離時(shí)為避免組織干燥，可在含少量培養(yǎng)液的器皿中進(jìn)行。

• 原代培養(yǎng)，特別是正常細(xì)胞的培養(yǎng)，應(yīng)采用營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)液，最好添加胎牛血清。

• 一般來說，胚胎組織較成熟個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化低的較分化高的組織容易生長(zhǎng)。

• 為了便于以后鑒別原代組織的來源和觀察細(xì)胞體外培養(yǎng)后與原組織的差異性，原代取材時(shí)要同時(shí)留好組織學(xué)標(biāo)本和電鏡標(biāo)本。

取材的基本器材和用品：

1、眼科組織彎剪、彎鑷、手術(shù)刀（用前消毒）；

2、裝有無(wú)血清培養(yǎng)基或Hanks液的小瓶；

3、小燒杯（10mL，50mL）;

4、培養(yǎng)皿。

不同組織取材方法

鼠胚組織的取材

因?yàn)樾∈蟮拿须[藏微生物較多，而且不易消毒，所以取材時(shí)更要注意無(wú)菌消毒，其無(wú)菌消毒一般采用以下方法進(jìn)行：

1、用引頸法殺死動(dòng)物，然后將其整個(gè)浸入盛有75%乙醇的燒杯中3~5min，注意時(shí)間不能太長(zhǎng)，以免乙醇從口和其他孔道進(jìn)入體內(nèi)，影響組織活力；

2、取出后放在消毒過的固定板上，用消毒過的圖釘或大頭針將其固定；

3、用眼科剪和止血鉗剪開皮膚解剖取材。

也可在乙醇消毒后，在動(dòng)物軀干中部環(huán)形剪開皮膚，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾把動(dòng)物反包，暴露軀干，然后再固定解剖取材。取好的組織要放置在另一干凈的無(wú)菌平皿中或玻璃板上進(jìn)行原代培養(yǎng)操作。動(dòng)物消毒后的操作宜在超凈臺(tái)內(nèi)或無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行。

雞胚組織的取材

一般使用雞胚時(shí)應(yīng)自行孵育。主要步驟為：精選新鮮受精雞蛋，擦掉表面的臟物，置37℃普通溫箱中孵育，箱內(nèi)同時(shí)放一盛水的平皿以維持培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度。一般采用9-12d的雞胚，在這期間，每天翻動(dòng)雞蛋1次。于無(wú)菌條件下，將蛋以氣室（大頭）向上放在1個(gè)小燒杯中，碘酒、乙醇消毒。用剪刀環(huán)形剪除氣室端蛋殼，切開蛋膜，暴露出雞胚，用鈍彎頭玻璃棒伸入蛋中輕輕挑起雞胚、放入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，根據(jù)需要取材。

皮膚和黏膜的取材

一般皮膚、黏膜主要取自手術(shù)過程中切除的部分組織；如特殊需要也可酌情單獨(dú)取材。方法似外科取斷層皮片手術(shù)的操作，但面積一般在2~3mm2即可。這樣局部不留瘢痕。注意取材時(shí)不要用碘酒消毒，必要時(shí)可用高濃度抗生素溶液漂洗。

內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材

內(nèi)臟和實(shí)體瘤取材時(shí)，一定要明確和熟悉自己所需組織類型和部位，要修剪去除不需要部分如血管、神經(jīng)和組織間的結(jié)締組織；取腫瘤組織時(shí)要盡可能取腫瘤細(xì)胞分布較多的部分，避開壞死液化區(qū)域。

血細(xì)胞的取材

一般多采用靜脈取血，微量時(shí)也可以從指尖或耳垂取血。為防止凝血常用肝素抗凝劑，抗凝劑的量以產(chǎn)生抗凝效果的最小量為宜，量過大易導(dǎo)致溶血。肝素常用濃度為20U/mL，抽血前針管要用濃度較高的肝素（500U/mL）濕潤(rùn)。抽血時(shí)要嚴(yán)格無(wú)菌。

骨髓、羊水、胸水、腹水內(nèi)細(xì)胞的取材

這幾種樣品取材后一般不需要其他處理，離心后最好立即培養(yǎng)，不宜低溫保存。

參考文獻(xiàn)

[1] 司徒鎮(zhèn)強(qiáng), 吳軍正. 細(xì)胞培養(yǎng)-第2版[M]. 世界圖書出版公司, 2007.