細(xì)胞學(xué)堂 | 如何解決bEnd.3細(xì)胞形態(tài)變化、難消化

bEnd.3 [BEND3] (小鼠腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞)是從來(lái)自患有內(nèi)皮瘤的小鼠腦組織中分離的內(nèi)皮細(xì)胞，該細(xì)胞通過(guò)表達(dá)多瘤病毒中間T抗原的NTKmT逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染而轉(zhuǎn)化。在培養(yǎng)時(shí)，bEnd.3細(xì)胞最常遇到的問(wèn)題就是細(xì)胞形態(tài)變化和難消化，本期細(xì)胞學(xué)堂將幫您逐一解決。

細(xì)胞形態(tài)問(wèn)題

bEnd.3細(xì)胞本身生長(zhǎng)較慢，在低密度時(shí)會(huì)呈現(xiàn)不規(guī)則細(xì)胞形態(tài)，高密度時(shí)則呈規(guī)則纖維狀，所以若在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)異常，則有可能是細(xì)胞密度低，建議細(xì)胞鋪滿密度較高時(shí)傳代。以下為bEnd.3細(xì)胞不同密度培養(yǎng)圖片：

低密度（100倍鏡）

中密度（100倍鏡）

高密度（100倍鏡）

消化問(wèn)題

消化時(shí)間

bEnd.3細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)越難消化，培養(yǎng)4天傳代，一般消化3-5分鐘；培養(yǎng)7天傳代，一般消化5-10分鐘。具體消化時(shí)間以顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)為準(zhǔn)。

培養(yǎng)7天，消化5分鐘顯微圖

培養(yǎng)7天，消化10分鐘顯微圖

難消化問(wèn)題

如遇到消化困難不必?fù)?dān)心，可通過(guò)分次消化的方式解決，具體操作方法如下（以T25瓶細(xì)胞為例）：

1、吸出原培養(yǎng)液；

2、加入2mL左右PBS，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤(rùn)洗細(xì)胞，吸出PBS丟棄；

3、加入1mL左右胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使之浸潤(rùn)所有細(xì)胞；

4、放入培養(yǎng)箱消化，消化3-5分鐘（根據(jù)具體細(xì)胞稍作延長(zhǎng)或縮短），顯微鏡下看到細(xì)胞開(kāi)始漂浮，可以加入2mLPBS，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使細(xì)胞懸浮，不要吹打剩下的貼壁細(xì)胞；

5、吸出培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的PBS和細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌離心管中，在離心管中加入3mL含血清的培養(yǎng)基終止消化并吹散細(xì)胞，使細(xì)胞盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液；

6、原培養(yǎng)瓶中加入0.5mL胰酶，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶浸潤(rùn)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)消化，直到細(xì)胞塊中間全部收縮變圓，晃動(dòng)培養(yǎng)瓶可脫落；

7、用3mL含血清的培養(yǎng)基終止消化，將瓶底的細(xì)胞全部吹下，并輕輕吹吸分散細(xì)胞呈單顆；

8、收集細(xì)胞懸液與第一次消化下來(lái)的細(xì)胞合并到一個(gè)離心管；

9、離心收集細(xì)胞沉淀，1200rpm/min 3分鐘，離心完吸出上清丟棄；

10、加入新鮮培養(yǎng)基，吹打幾下混勻細(xì)胞，按需接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng)；

11、檢查培養(yǎng)箱二氧化碳，溫度和水盤。

培養(yǎng)小貼士

1、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)多樣，低密度時(shí)容易出現(xiàn)放射狀細(xì)胞，看似已經(jīng)鋪滿瓶底，其實(shí)細(xì)胞量較少，需要細(xì)胞胞體排列緊密的時(shí)候進(jìn)行傳代；

2、細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中避免頻繁換液，可以每隔2-3天換液或者半量換液一次；

3、培養(yǎng)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生10%左右活的單顆漂浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞密度偏低時(shí)，注意收集懸浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞密度偏高時(shí)，可以換液時(shí)丟棄；

4、接種量對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有影響，接種量過(guò)低細(xì)胞會(huì)有增殖緩慢，漂浮過(guò)多的現(xiàn)象，請(qǐng)注意控制傳代比例；

5、細(xì)胞對(duì)溫度和pH較敏感，傳代或換液前培養(yǎng)基可以常溫復(fù)溫4小時(shí)以上；避免使用pH改變（偏酸：顏色偏黃；偏堿：顏色偏紫紅）的培養(yǎng)基；

6、細(xì)胞傳代過(guò)程中若出現(xiàn)單次消化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可進(jìn)行分次消化，切不可將細(xì)胞強(qiáng)行吹下來(lái)，以避免吹打造成細(xì)胞機(jī)械損傷。