必備實驗技能之——手把手教你細(xì)胞計數(shù)

       在細(xì)胞培養(yǎng)中，細(xì)胞計數(shù)是一項基本功，遙想當(dāng)年，剛剛進(jìn)入實驗室開始做細(xì)胞實驗時，最讓小編頭疼的就是給細(xì)胞計數(shù)了，雖然比較簡單，但是經(jīng)常暈頭轉(zhuǎn)向、數(shù)到眼瞎，而且萬一一個不小心被其他人打斷了思路，分分鐘前功盡棄。

　　其實，之所以覺得數(shù)細(xì)胞如此辛苦，很大一部分原因是還沒有掌握細(xì)胞計數(shù)的正確操作，當(dāng)儀器對細(xì)胞計數(shù)分類出現(xiàn)異常時，手工顯微鏡檢查就顯的尤為重要。下面小編給大家總結(jié)下細(xì)胞計數(shù)的詳細(xì)步驟的方法，供大家參考。

1、首先準(zhǔn)備好細(xì)胞計數(shù)器(血球計數(shù)板)

　　使用70%乙醇將蓋玻片和細(xì)胞計數(shù)板清潔、晾干備用。

　　將晾干的蓋玻片輕輕覆蓋至血細(xì)胞計數(shù)器上。

　　(注：使用前須保證蓋玻片和計數(shù)板已充分晾干，否則將影響后續(xù)細(xì)胞充池及計數(shù)結(jié)果。)

2、制備細(xì)胞懸液

　　對于貼壁生長的細(xì)胞，我們需要首先使用胰酶消化的方法使細(xì)胞從培養(yǎng)皿表面脫落。(懸浮細(xì)胞則無需消化，稀釋到合適倍數(shù)即可。)

　　然后加入適當(dāng)?shù)暮迮囵B(yǎng)基，中和胰酶的作用并重懸細(xì)胞，以得到均質(zhì)的細(xì)胞懸液。要求盡可能將細(xì)胞吹散，不要殘留任何細(xì)胞團(tuán)，但不可用力過大。

　　(注：消化太過或消化不全均會使計數(shù)結(jié)果產(chǎn)生偏差。)

　　臺盼蘭染色(可選)：

　　如果需要計算細(xì)胞的活率，則需要將細(xì)胞懸液和0.4%臺盼蘭等體積混合;

　　室溫孵育3-5分鐘(懸浮細(xì)胞染色時間可視情況適當(dāng)延長)，使臺盼蘭完全進(jìn)入死細(xì)胞，使死細(xì)胞著藍(lán)色。

3、血細(xì)胞計數(shù)器加樣

　　使用吸管或移液器將細(xì)胞懸液或細(xì)胞/臺盼蘭混合液滴加到計數(shù)池的邊緣。此時液滴將在虹吸的作用下進(jìn)入蓋玻片下方的計數(shù)池，此即為充池。

　　(注：若需進(jìn)行多個樣品的計數(shù)，應(yīng)盡量保證每次充池的體積一致，一般在10μl/池左右。)

　　以同樣的方式在另一側(cè)的計數(shù)池中也加入計數(shù)樣品。

　　將計數(shù)板靜置幾分鐘使細(xì)胞擴(kuò)散、沉降。

4、細(xì)胞計數(shù)

　　在100倍顯微鏡下，移動計數(shù)板將視野對準(zhǔn)計數(shù)板的中央大方塊，該方塊四周有一圈3條平行線包圍，中間有密集的網(wǎng)格。中央方塊區(qū)差不多剛好可以填滿整個視野(下圖標(biāo)記的3號位置)。

       分別計數(shù)大方格1.2.4.5中的細(xì)胞數(shù)。(為降低計數(shù)誤差，最好將細(xì)胞濃度調(diào)整為20-50個/大方格。)并重復(fù)記錄另一側(cè)計數(shù)池中的細(xì)胞數(shù)，總計8個大方塊，然后取均值。

　　計數(shù)原則為：“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右”。(判斷標(biāo)準(zhǔn)為是否接觸三條邊線的中間線，如下圖所示)

       如果有多個細(xì)胞沒有吹散而成團(tuán)存在，此時只可記為一個細(xì)胞。如果團(tuán)塊很多，則需重新吹打甚至重新取樣消化直至絕大多數(shù)細(xì)胞為單個細(xì)胞。

5、細(xì)胞濃度

由上圖可以得出，每個大方格的容積為：

　　1 mm2×0.1 mm = 0.1 mm3 =10-4 cm3= 10-4 ml

　　即每個大方格的容積為萬分之一毫升，因此在計算每毫升液體中的細(xì)胞數(shù)時需乘以104。

　　在常規(guī)沒有使用臺盼蘭染色時，可以以下面公式計算每毫升樣品中細(xì)胞的個數(shù)：

　　每毫升樣品中細(xì)胞的個數(shù) = 每個大方格內(nèi)細(xì)胞的平均數(shù) × 細(xì)胞稀釋倍數(shù)×104

　　如果使用了臺盼蘭染色，還需要計算活細(xì)胞的百分率：

　　活細(xì)胞百分率(%)= 臺盼蘭拒染細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100

　　此時活細(xì)胞數(shù)的計算公式為：

　　每毫升樣品中活細(xì)胞的個數(shù) = 每個大方格中細(xì)胞的平均數(shù)×活細(xì)胞比率×細(xì)胞稀釋倍數(shù)×2×104

　　注：乘2是由于在臺盼蘭染色時，進(jìn)行了等體積混合，相當(dāng)于稀釋了一倍。

　　看了以上步驟和原理，大家不禁會問：我們?yōu)槭裁匆獢?shù)細(xì)胞啊?細(xì)胞計數(shù)究竟有什么意義呢?其實，當(dāng)我們想了解細(xì)胞的生長情況時，除了直接觀察細(xì)胞形態(tài)以外，繪制細(xì)胞生長曲線、計算細(xì)胞倍增時間應(yīng)該就是廣泛采用的評價指標(biāo)了。

　　所以盡管使用血細(xì)胞計數(shù)板手工計數(shù)細(xì)胞過程十分繁瑣，對實驗者操作者的要求也比較嚴(yán)格，現(xiàn)在也已有很多自動化的細(xì)胞計數(shù)器/儀，但對于科學(xué)研究中遇到的各種細(xì)胞而言，手工計數(shù)仍然是最簡便易行的方法而被廣大實驗室采用。