雙管齊下！Annexin V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

       細(xì)胞死亡的方式主要有兩種，包括細(xì)胞壞死(necrosis)和細(xì)胞凋亡(apoptosis)。細(xì)胞壞死是早已被認(rèn)識(shí)到的細(xì)胞死亡方式，而細(xì)胞凋亡是近年來(lái)逐漸被認(rèn)識(shí)且越來(lái)越受到重視的細(xì)胞死亡方式。兩種死亡方式最重要的區(qū)別是細(xì)胞壞死會(huì)釋放出細(xì)胞內(nèi)溶物，引起炎癥反應(yīng)，而細(xì)胞凋亡不會(huì)暴露細(xì)胞內(nèi)溶物，一般被吞噬細(xì)胞吞噬清除，不引起炎癥反應(yīng)。

　　細(xì)胞凋亡(apoptosis)指為維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡。凋亡的發(fā)生并不是一蹴而就，因此，針對(duì)不同凋亡事件的檢測(cè)方法眾多種多樣，常用的方法包括細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察，磷脂酰絲氨酸外翻分析，檢測(cè)線粒體膜勢(shì)能，檢測(cè)片段化的DNA所采用的Tunel法，Caspase活性檢測(cè)，凋亡相關(guān)蛋白的檢測(cè)等。

　　今天，我們討論的方法是——磷脂酰絲氨酸外翻分析，也就是通過(guò)Annexin V和PI的聯(lián)合使用，最終可判斷細(xì)胞凋亡的各個(gè)階段，這個(gè)方法是目前非常熱門的研究方法，被大家廣泛使用。

那么，Annexin V/PI法的原理是什么?

　　正常細(xì)胞膜的磷脂分布是不對(duì)稱的，活細(xì)胞中磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，細(xì)胞凋亡時(shí)，細(xì)胞膜發(fā)生變化，PS從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面。

　　annexinV是一種對(duì)PS有高度親和力的、鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白，annexinV可以特異性地識(shí)別凋亡細(xì)胞表面的PS，而活細(xì)胞的PS位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，無(wú)法與annexinV特異性結(jié)合。

　　所以可以用FITC偶聯(lián)的annexinV鑒別凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞。

　　壞死細(xì)胞的PS也會(huì)從細(xì)胞膜的內(nèi)表面翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表面，annexinV也能識(shí)別壞死細(xì)胞表面的PS，所以annexinV無(wú)法區(qū)分壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞。

　　而PI染料能夠與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，區(qū)分壞死細(xì)胞和活細(xì)胞。凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞的細(xì)胞膜仍然完整，PI染料無(wú)法自由通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合，所以PI染料無(wú)法標(biāo)記凋亡細(xì)胞和活細(xì)胞，而PI染料卻能夠通過(guò)壞死細(xì)胞的細(xì)胞膜與細(xì)胞內(nèi)的DNA結(jié)合，壞死細(xì)胞內(nèi)PI染料被488nm激光激發(fā)后會(huì)發(fā)射紅熒光，被FL2或FL3通道接收。

　　所以annexinV和PI同時(shí)使用，就可以雙管齊下，區(qū)分活細(xì)胞、凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，這就是annexinV/PI雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的原理。

Annexin V和PI聯(lián)用檢測(cè)細(xì)胞凋亡示意圖如下：

細(xì)胞消化重懸后，加入Annexin V和PI以及染色Buffer，正常細(xì)胞不會(huì)被Annexin V和PI標(biāo)記上。

早期凋亡的細(xì)胞，膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸外翻(圖中粉色結(jié)構(gòu))，此時(shí)磷脂酰絲氨酸會(huì)和Annexin V結(jié)合。

晚期凋亡的細(xì)胞，膜結(jié)構(gòu)破損，此時(shí)PI會(huì)進(jìn)入細(xì)胞，故晚期凋亡的細(xì)胞會(huì)被Annexin V和PI標(biāo)記上。

Procell Annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒實(shí)驗(yàn)效果圖如下：

Jurkat細(xì)胞用1μM喜樹(shù)堿(Camptothecin) (左) 或未加藥 (右) 處理4 h，Annexin V-FITC/PI檢測(cè)試劑盒染色后FCM檢測(cè)。Annexin V-FITC單陽(yáng)為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI雙陽(yáng)細(xì)胞為壞死或晚期凋亡細(xì)胞，PI單陽(yáng)細(xì)胞為裸核細(xì)胞。

Procell檢測(cè)細(xì)胞凋亡產(chǎn)品列表

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