細(xì)胞消化經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：你的細(xì)胞消化好了嗎?

細(xì)胞培養(yǎng)，是一件需要不斷積累的實(shí)驗(yàn)室必備技能，細(xì)胞消化是細(xì)胞培養(yǎng)中不是那么復(fù)雜的一個(gè)步驟，雖然這個(gè)步驟不難，但是還是有很多人會(huì)“栽”在這一步上，比如對一些增殖比較快的細(xì)胞來說，如果你沒有掌握好細(xì)胞消化的時(shí)間，那么，這些細(xì)胞就很有可能會(huì)由于營養(yǎng)物質(zhì)缺乏或者細(xì)胞接觸性抑制而導(dǎo)致狀態(tài)變差或死亡，這樣你的實(shí)驗(yàn)就不可避免的延期了，所以，細(xì)胞消化也需要我們好好去探索一番。

細(xì)胞什么時(shí)候需要消化?

　　一般細(xì)胞長至80%-90%密度則需要傳代消化，貼壁細(xì)胞傳代前，需要把細(xì)胞用消化試劑從培養(yǎng)容器表面解離出來，細(xì)胞得以分離成單個(gè)懸液傳代至含新鮮培養(yǎng)基的新容器內(nèi)。

　　細(xì)胞消化的方法主要有四種：

一、酶消化法

　　這個(gè)方法是用得最多的，主要是用胰蛋白酶，一般濃度在0.25-0.5% ，消化的時(shí)間根據(jù)細(xì)胞種類、作用溫度等因素而變化，一般是從從幾分鐘到幾十分鐘不等。

　　一般來說，0.25% 的胰酶作用于單層貼壁的細(xì)胞，在37度條件下消化1-5 分鐘就足夠了。

　　需要注意的是，Ca2+ 、 Mg2+ 和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，因此不含Ca2+、 Mg2+ ，含EDTA的胰酶活性更高;

　　最后，可用含血清的培養(yǎng)基終止胰酶消化。胰酶對溫度敏感，需在-20℃運(yùn)輸和保存，不能反復(fù)凍融。

二、離子螯合劑

　　離子螯合劑不破壞細(xì)胞表面分子，僅與CAMs螯合，因此，如果檢測細(xì)胞表面分子的話，盡量，甚至是一定不要用酶消化法。

　　一般用得最多的是EDTA，一般濃度在0.02% 左右，作用于細(xì)胞與間質(zhì)，對細(xì)胞間也有一定作用。

　　注意，它能顯著影響pH值，而且在弱堿性條件下才易溶，因此配制時(shí)應(yīng)調(diào)節(jié)好酸堿度，

　　這種方法相對來說操作簡單，無需使用蛋白或血清終止。

三、物理法

　　也就是直接吹打或用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮下來。

四、冷凍法

　　這種僅能用于細(xì)胞傳代時(shí)，因?yàn)樗鼰o法使組織上的細(xì)胞脫落下來。本方法的原理，主要是因細(xì)胞冷凍后收縮，從而從培養(yǎng)瓶上脫落下來。優(yōu)點(diǎn)是：對細(xì)胞損傷小，不需要中止或洗細(xì)胞，也不需要另外配制消化液。特別適用那些貼壁不是特別緊，又特別嬌氣的細(xì)胞，不足是細(xì)胞可能會(huì)常小片脫落。

細(xì)胞的狀態(tài)怎么樣才算消化好了?

　?、俨皇羌?xì)胞分布很離散的單個(gè)圓形才算消化好了

　　一般顯微鏡觀察貼壁細(xì)胞，只要能移動(dòng)了，多半呈沙狀移動(dòng)，其實(shí)已經(jīng)可以了，很多人喜歡把細(xì)胞消化或者吹打成完全分離細(xì)胞，這是沒有必要的。一般能移動(dòng)了， 說明細(xì)胞之間，細(xì)胞與培養(yǎng)皿之間的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞已經(jīng)獨(dú)立分布了(雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布)，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。

　?、诓皇撬屑?xì)胞消化后都會(huì)變成圓形

　　有些細(xì)胞(比如U87，U251)消化好了也不會(huì)變成圓形，只是呈半沙狀。

　　③有些細(xì)胞即使變圓，也有脫落的細(xì)胞，但還是沒消化好

　　比如7860，要等到大部分細(xì)胞脫落培養(yǎng)皿底部才可以停止消化，否則很難吹打下來，這種情況一般發(fā)生于難以消化的細(xì)胞。

　　④對于一些特殊的細(xì)胞需要消化過一點(diǎn)

　　有些細(xì)胞吹成單個(gè)細(xì)胞反而對細(xì)胞的狀態(tài)會(huì)好一點(diǎn)，一但成團(tuán)，細(xì)胞狀態(tài)立馬變差，比如LNCAP細(xì)胞。

消化過度的主要特征有哪些?

　　會(huì)導(dǎo)致相當(dāng)一部分細(xì)胞損傷和死亡，剛傳代后的培養(yǎng)液表面漂浮細(xì)胞團(tuán)，肉眼可見漂著小片白色膜狀物。如果細(xì)胞團(tuán)中都是死細(xì)胞，則不會(huì)貼壁。如果細(xì)胞團(tuán)中仍存在有活力的細(xì)胞，就會(huì)貼壁造成局部細(xì)胞密度不均勻，該局部較快形成中央壞死細(xì)胞區(qū)。

細(xì)胞消化過度怎么處理?

　　馬上用培養(yǎng)基中和，用吸管吹打細(xì)胞， 收集全部的細(xì)胞到以無菌的離心管中800RPM 3 分鐘。棄上清，用全培重懸，換新的培養(yǎng)瓶繼續(xù)培養(yǎng)!! 狀態(tài)不好的細(xì)胞在培養(yǎng)的過程中會(huì)死亡脫落，在換液的時(shí)候可以清除掉!!

細(xì)胞消化不下來是什么情況?

　　(1)有些細(xì)胞貼壁比較牢，因此每次消化吹打之后總會(huì)剩下一些細(xì)胞，或者細(xì)胞長得較好而培養(yǎng)瓶太久沒換，為了顧全大部分有活力的細(xì)胞，細(xì)胞消化要適可而止。

　　(2)不同種類的細(xì)胞所需消化時(shí)間也不同。因?yàn)橘N壁細(xì)胞的消化一般在2分鐘左右，對于個(gè)別出現(xiàn)的細(xì)胞難以消化，經(jīng)過多次消化和反復(fù)吹打之后仍無效，就放棄吧。

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