大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞的分離提取

骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）來源于中胚層，是具有多分化潛能的細胞。細胞生物學(xué)表明，BMSCs具有較強的增殖能力和多向分化潛能。在不同誘導(dǎo)條件下，可向中胚層細胞如脂肪細胞、成骨細胞、肌細胞等分化。BMSCs 是理想的種子細胞來源之一，在細胞替代治療、基因治療及組織器官再造中具有重要的臨床應(yīng)用價值。

本期細胞學(xué)堂為大家整理了大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞分離提取的方法、注意事項及鑒定指標，幫助您快速上手開展實驗。

分離提取步驟

1、骨髓取材

將大鼠斷頸處死后, 置于75%醫(yī)用酒精內(nèi)浸泡5~10 min，消毒后將動物轉(zhuǎn)運至超凈工作臺內(nèi)。無菌分離雙側(cè)股骨和脛骨，用新的剪刀鑷子清除股骨脛骨周圍肌肉組織；保持骨頭完整，留取純凈骨頭，將組織轉(zhuǎn)移至新的含有PBS的培養(yǎng)皿內(nèi)，剪去骨干的兩端, 暴露骨髓腔；取注射器，吸取培養(yǎng)基，從骨頭一端插針，沖洗骨髓（至骨頭發(fā)白透亮），反復(fù)吹打制成單細胞懸液。

2、分離方法

BMSCs常見的分離方法有密度梯度離心法、貼壁法以及免疫磁珠分選法，大家可以根據(jù)自己實驗室條件來選擇合適的分離方法。

(1) 密度梯度離心法

將裝有大鼠骨髓液的15 mL離心管，1500rpm離心5 min；棄上清，用完全培養(yǎng)基重懸沉淀；將培養(yǎng)基重懸的細胞懸液緩慢滴加到Percoll分離液（用PBS稀釋）上方，形成密度梯度分離液；2000~2500rpm離心25 min，吸取中間層的白色霧狀細胞層，加入PBS清洗細胞，1800rpm離心5 min；棄上清，保留細胞沉淀；用細胞完全培養(yǎng)基重懸沉淀，將細胞懸液按1×106/mL密度接種于T25瓶中，于37℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。首次2d換液，棄去未貼壁細胞, 此后每2~3 d換液一次；待細胞融合達80%后, 用胰酶消化1~2 min后傳代培養(yǎng)。

(2) 貼壁法

也稱全骨髓培養(yǎng)法或一步法。將收集的骨髓懸液經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾后，用完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液；培養(yǎng)48h首次換液，棄去未貼壁細胞；此后每2~3d換液一次，觀察細胞的生長及融合程度，待細胞融合80%以上后開始傳代培養(yǎng)。

(3) 流式細胞儀或免疫磁珠分選法

免疫磁珠法和流式細胞儀分選法通過識別細胞表面特異性抗原分離細胞，可獲得純度較高的細胞，但對細胞的活性影響較大，獲得的細胞量少，需要特殊的儀器，實際應(yīng)用受限。

注意事項

取材嚴格無菌操作。除基本的無菌要求外,在剪取大鼠的雙下肢及剝離皮毛后，應(yīng)更換取材器械，避免取材和分離骨髓間的交叉污染；

培養(yǎng)基營養(yǎng)要充足。血清濃度可摸索調(diào)整，培養(yǎng)時可額外添加生長因子；

采用密度梯度離心法時，Percoll分離液最好是現(xiàn)配現(xiàn)用。此外，分離液和細胞懸液的比例應(yīng)合適，一般采用1∶1；

注意細胞接種密度、換液時間。密度過低會影響細胞貼壁、融合。不同的操作方法中換液、傳代時間各異，根據(jù)細胞生長狀況及時調(diào)整換液、傳代時間。

鑒定指標

1、細胞形態(tài)學(xué)觀察

剛分離提純的原代細胞形態(tài)呈圓形，大小不一，漂浮于培養(yǎng)液中（圖1）。經(jīng)純化貼壁后可見，細胞呈成纖維樣緊密排列，漩渦樣生長，胞核大、清晰、呈長梭形，細胞形態(tài)趨于統(tǒng)一（圖2），其形態(tài)符合BMSCs的貼壁形態(tài)。

圖1 大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞剛分離，呈圓形

圖2 普諾賽實驗室提純的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞

2、表面標志物

目前使用較多的是CD90、CD29、CD44等陽性表達指標。

普諾賽實驗室提取的大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞CD90表達

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