細(xì)胞凋亡：Annexin V-FITC/PI法的原理及注意事項(xiàng)

       細(xì)胞最主要的死亡方式有2種，包括細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡，其中細(xì)胞壞死是很早就被發(fā)現(xiàn)的，而細(xì)胞凋亡是近年來被發(fā)現(xiàn)的，并且越來越被重視，最近幾年也一直是非常的熱門。

　　這是因?yàn)?，對于?xì)胞凋亡的檢測可以用于腫瘤細(xì)胞和組織在內(nèi)的不同種類病理標(biāo)本研究，并且還能應(yīng)用于臨床診療，新藥研制、生物制品開發(fā)、腫瘤放化療、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因治療，對相關(guān)疾病的早期發(fā)現(xiàn)、放化療的療效評價(jià)具有舉足輕重的地位，所以，細(xì)胞凋亡才如此火熱。

　　大家都知道，檢測細(xì)胞凋亡的方法有很多，那么，為什么其中Annexin V和PI雙染法最為經(jīng)典呢?這里我們就需要從它的原理開始說起。

Annexin V-FITC/PI法的原理：

　　正常細(xì)胞(活細(xì)胞)具有完好的細(xì)胞膜，此時(shí)細(xì)胞膜的組分之一——磷脂酰絲氨酸(phosphotidylserine，PS)位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，這使得原本在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的PS外翻到細(xì)胞膜的表面，這種現(xiàn)象在凋亡的早期就會出現(xiàn)，因此就可以用與PS具有高親和力、標(biāo)記了熒光素的膜連蛋白V(Annexin V)來檢測早期凋亡的細(xì)胞。

由于晚期凋亡和一些壞死的細(xì)胞也可以與Annexin V結(jié)合，因此需要引入另一種指標(biāo)來將早期凋亡的細(xì)胞與之區(qū)分，這種指標(biāo)就是細(xì)胞膜的通透性。與正常細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞不同，晚期凋亡及壞死細(xì)胞的膜通透性會增加，因此，一些原本不能進(jìn)入到正常細(xì)胞內(nèi)的核酸染料(如PI)便有機(jī)會進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與DNA結(jié)合。

　　所以，通過Annexin V和PI雙染的方法，就可以把早期凋亡的細(xì)胞與晚期凋亡加壞死的細(xì)胞區(qū)分開來。

Annexin V-FITC/PI法的實(shí)驗(yàn)步驟：

　　1、細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)方案進(jìn)行凋亡誘導(dǎo)，300g離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞一次，輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

　　2、取1-5×10^5重懸的細(xì)胞，300g離心5min，棄上清。用PBS洗滌細(xì)胞一次，離心后棄上清，加入500μL稀釋的1×Annexin V Binding Buffer工作液重懸細(xì)胞。

　　3、細(xì)胞懸液中加入5μL的Annexin V-APC和5μL的7-AAD染色液。

　　4、輕柔渦旋混勻后，室溫避光孵育15-20min。

　　5、反應(yīng)完成后立即上機(jī)檢測。如不能及時(shí)檢測，請于冰上避光靜置并于1小時(shí)內(nèi)完成檢測。

實(shí)驗(yàn)時(shí)對照組凋亡比例高的原因

　　1、細(xì)胞狀態(tài)不好;

　　2、細(xì)胞收集后存放的時(shí)間太長，沒有及時(shí)染色;

　　3、細(xì)胞表面原有的PS相對較多，應(yīng)選用低濃度的AnnexinV標(biāo)記;

　　4、PBMC表面往往有血小板黏附在細(xì)胞表面，造成Annexin V陽性率偏高;

　　5、過分吹打、震蕩或胰酶消化等，可能使PS暴露出來。

實(shí)驗(yàn)時(shí)處理組凋亡比例低的原因

　　1、凋亡刺激得不夠;

　　2、細(xì)胞本身生長狀態(tài)可能對刺激因素不敏感，如過度增殖的細(xì)胞對凋亡的誘導(dǎo)不太敏感;

　　3、Annexin V的結(jié)合緩沖液失效，應(yīng)4 ℃保存;

　　4、貼壁細(xì)胞消化時(shí)間過長，膜表面的PS受損，Annexin V結(jié)合位點(diǎn)減少。

　　Annexin V-FITC/PI法適合所有細(xì)胞嗎?

　　最適合懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞，對于貼壁生長的細(xì)胞，最好用不含EDTA的胰酶消化收集，且消化時(shí)間不易過長。可將胰酶消化后的細(xì)胞保存在含2%BSA的PBS中，防止進(jìn)一步的損傷。

　　某些細(xì)胞的細(xì)胞膜外表面帶有大量的PS，因而也不能使用該方法(比如巨核細(xì)胞、血小板、某些骨髓系細(xì)胞)。

其它注意事項(xiàng)：

　　1、必須活細(xì)胞檢測，不能用能破壞細(xì)胞膜完整性的固定劑和穿透劑固定或穿膜。

　　2、由于Annexin-V為鈣離子依賴的磷脂結(jié)合蛋白，只有在鈣離子存在的情況下與PS的親和力才大，因而在消化細(xì)胞時(shí)，建議一般不采用含EDTA的消化液。

　　3、必須設(shè)置陰性對照和補(bǔ)償對照(分別單染)。

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　　3、檢測早期凋亡最理想的方法，不需固定環(huán)節(jié)從而避免相關(guān)的假陽性;

　　4、只需15-20分鐘，簡單快捷;

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實(shí)驗(yàn)效果圖如下：

圖：Jurkat細(xì)胞用1μM喜樹堿(Camptothecin) (左) 或未加藥 (右) 處理4 h，Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒染色后FCM檢測。Annexin V-FITC單陽為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI雙陽細(xì)胞為壞死或晚期凋亡細(xì)胞，PI單陽細(xì)胞為裸核細(xì)胞。

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