經(jīng)驗(yàn)總結(jié)：原代細(xì)胞分離提取的注意事項(xiàng)

原代細(xì)胞分離是指將組織分散制成細(xì)胞懸液后從中獲取目的細(xì)胞的過(guò)程，獲得高純度、高活性的原代細(xì)胞則是很多細(xì)胞實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵要素之一，但是，很多小伙伴會(huì)在這個(gè)關(guān)鍵步驟會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題，今天我們就主要來(lái)聊聊這個(gè)問(wèn)題。

首先，原代細(xì)胞分離的方法有很多種：

　　原代細(xì)胞是直接取自活組織(例如活組織檢查材料)的細(xì)胞，并建立用于體外生長(zhǎng)。這些細(xì)胞經(jīng)歷了非常少的群體倍增，因此與連續(xù)(腫瘤或人工永生化)細(xì)胞系相比，它們更能代表它們所衍生組織的主要功能成分，使得原代細(xì)胞成為更具代表性的體內(nèi)模型。

　　所以，自己動(dòng)手分離原代細(xì)胞，是非常有必要的。

　　原代細(xì)胞分離方法有許多種：懸浮離心法、直接組織塊法、酶消化法、非酶消化法、機(jī)械分散法等，今天，我們主要來(lái)看看最常用的方法——酶消化法。

原代細(xì)胞分離提取優(yōu)化七步法

　　1、無(wú)菌

　　確保使用無(wú)菌設(shè)備、試劑和技術(shù)收集和處理組織。使用個(gè)人防護(hù)設(shè)備以避免污染。使用0.22微米的膜無(wú)菌過(guò)濾所有酶和試劑。

　　2、切塊

　　用無(wú)菌剪刀或手術(shù)刀將組織標(biāo)本切成小塊(通常為2×4mm)，然后將小塊放入選定的緩沖液、培養(yǎng)基或鹽溶液中。

　　3、加酶

　　將組織清洗三次以消除多余的血液蛋白，然后加入您選擇的酶如膠原酶、蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶。通常，約0.5 mg/ml～1.5 mg/ml的酶。

　　4、孵育

　　將組織樣本在其最佳溫度下孵育，通常在37℃下孵育30～90分鐘。定期混合或輕輕搖動(dòng)標(biāo)本。

　　5、洗滌

　　通過(guò)輕輕移液來(lái)分散細(xì)胞(也稱為研磨)，然后，使用細(xì)網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞懸浮液。讓細(xì)胞沉淀并潷出多余的含液酶;洗兩到三次。含有FBS，BSA或其他抑制劑的洗滌溶液也可用于阻止酶消化。

　　6、分析

　　將細(xì)胞重懸于正確的培養(yǎng)基或緩沖液中，然后定量測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)量和活力。這是細(xì)胞分離過(guò)程中的重要步驟，因此您可以評(píng)估解離技術(shù)的結(jié)果。大多數(shù)研究人員使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)定細(xì)胞產(chǎn)量，并使用臺(tái)盼藍(lán)重氮染料測(cè)量細(xì)胞活力。

　　7、培養(yǎng)

　　這個(gè)適合，就可以根據(jù)所分離的細(xì)胞來(lái)選擇最適合研究的方案和處理步驟來(lái)培養(yǎng)細(xì)胞了。

重點(diǎn)注意事項(xiàng)：

　　1、使用細(xì)胞分離酶時(shí)，請(qǐng)注意溫度和濕度條件。如蛋白水解酶可以自動(dòng)分解，因此建議在使用前立即將其溶解，并在冰上保存2°C～8°C。

　　2、通常用于細(xì)胞分離的大多數(shù)酶可以直接溶解于平衡鹽溶液或所選緩沖液中。對(duì)于許多細(xì)胞分離中，確保解離期間的組織存活，需要孵育培養(yǎng)基充分氧化并在生理pH下緩沖。95%O2、5%CO2平衡的介質(zhì)來(lái)完成。

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