最“炫”流式結(jié)果圖：Annexin V/PI法測細(xì)胞凋亡中的小細(xì)節(jié)

大名鼎鼎的Annexin V-FITC/PI雙染法，是大家最常的流式凋亡檢測方法。但是想得到一組既漂亮又“炫”的流式結(jié)果圖卻不是一件容易的事情，需要同學(xué)們每一步都做到精致完美，任何一個小環(huán)節(jié)的失誤，都會使幾天的努力功虧于潰，毀于一旦。

那么，整個細(xì)胞凋亡實驗過程需要注意些什么問題？有哪些不能忽略的實驗小細(xì)節(jié)呢？今天，我們一起來學(xué)習(xí)學(xué)習(xí)。

Annexin V-FITC/PI雙染法基本原理

在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)位于細(xì)胞膜的胞漿側(cè)。細(xì)胞發(fā)生早期凋亡后，PS外翻到胞膜側(cè)，Annexin V對PS有高度親和力，用FITC標(biāo)記Annexin V，PS外翻的細(xì)胞由于結(jié)合Annexin V-FITC發(fā)出綠色熒光。凋亡晚期，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)受損，碘化丙啶(PI)透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)胞同時發(fā)出紅色熒光和綠色熒光。同時檢測Annexin V-FITC(綠色熒光)和PI(紅色熒光)的信號，對早期凋亡和晚期凋亡的細(xì)胞比例進(jìn)行分析。

實驗中的小細(xì)節(jié)

一、如果可以，盡量選擇活力旺盛的“青年”細(xì)胞

　　細(xì)胞凋亡想做好，細(xì)胞狀態(tài)選擇最重要。

　　為什么要選擇活力旺盛的細(xì)胞?大家都知道生長代數(shù)越靠前的細(xì)胞活力越旺盛，在條件容許的前提下，盡量選取傳代次數(shù)較少的細(xì)胞。

　　為什么要選擇“青年”的細(xì)胞?培養(yǎng)器皿中的細(xì)胞是一個微形群體。傳代后，營養(yǎng)物質(zhì)充裕，細(xì)胞群體中的“baby”細(xì)胞比較多。隨著不斷生長分裂，細(xì)胞數(shù)越來越多。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到80%左右時，群體中的“青年”細(xì)胞的比例達(dá)到頂峰，此時的細(xì)胞狀態(tài)最好，最適宜做凋亡實驗。如果細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，生存空間不足，營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，“老年”細(xì)胞逐漸變多，此時檢測到細(xì)胞本身凋亡百分率就會很高。

二、過度消化會損傷細(xì)胞

　　流式檢測的樣本必須是單細(xì)胞懸液，對于貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，需要用胰酶降解細(xì)胞間結(jié)合處蛋白，使細(xì)胞相互分離。但胰酶是一把雙刃劍，如果處理時間太長，也會損傷細(xì)胞。所以需要盡量去除延長消化時間的因素，比如，盡量去除清洗培養(yǎng)基的PBS，避免殘留PBS稀釋胰酶。當(dāng)樣本較多時，建議分組消化細(xì)胞，嚴(yán)格控制胰酶處理時間在1分鐘內(nèi)。

三、胰酶消化，加EDTA or not?

　　EDTA螯合鈣離子，影響Annexin V和細(xì)胞膜上的蛋白結(jié)合，因此許多凋亡試劑盒的protocol都特別標(biāo)明，用于細(xì)胞凋亡實驗的胰酶不能含有EDTA。從另一個方面講，胰酶中加入EDTA，可以加快細(xì)胞從培養(yǎng)器皿上脫離的速度，避免胰酶長時間消化造成的細(xì)胞損傷。

　　胰酶中到底要不要加EDTA?是一個兩難的選擇?

　　其實，應(yīng)該具體問題具體分析，有的細(xì)胞容易消化，當(dāng)然用不含EDTA的胰酶。如果用胰酶消化幾分鐘后，大部分細(xì)胞仍然牢牢地吸附在培養(yǎng)器皿上，就建議選擇含有EDTA的胰酶消化細(xì)胞，可以通過洗滌去除EDTA來保證Annexin V和細(xì)胞膜上的蛋白結(jié)合。

四、染色前或染色后的細(xì)胞可不可以固定?

　　當(dāng)然不可以。如果你溫習(xí)細(xì)胞凋亡檢測的基本原理，就知道，固定會破壞細(xì)胞的完整性，使PI透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，提高細(xì)胞的凋亡百分率。所以，染色前和染色后的細(xì)胞都不可以固定，并且染色后的細(xì)胞需要在1小時內(nèi)上流式檢測。

五、表達(dá)GFP熒光的細(xì)胞是否可以使用此方法檢測?

　　當(dāng)然不可以。GFP和FITC都由488nm激光激發(fā)，二者發(fā)射光譜有極大的重疊。如果表達(dá)GFP熒光的細(xì)胞用此法檢測細(xì)胞凋亡，F(xiàn)L1通道獲得的熒光信號就是GFP和FITC的加和，不能真實地反應(yīng)細(xì)胞凋亡的變化。所以，被檢測細(xì)胞本身不能發(fā)出與FITC或者PI染料有光譜重疊的光。如果有，果斷換用其他檢測方法。

六、每個細(xì)胞都需要被溫柔以待!

　　機(jī)械力會損傷細(xì)胞，操作過程中的任何暴力行為，都會使細(xì)胞本身凋亡百分率變高。要想實驗結(jié)果好，盡量地少吹打細(xì)胞，因為每個細(xì)胞都值得被溫柔以待!

　　注意好以上這些小細(xì)節(jié)，你才能得到一張“炫”麗多彩的流式結(jié)果圖，但是，如果細(xì)節(jié)都到位了，實驗還是做不好該怎么辦？——或許你可以嘗試使用更優(yōu)質(zhì)的Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒。

推薦——Procell Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒

　　Procell自主研發(fā)的Annexin V系列凋亡試劑盒，用于鑒定凋亡和壞死的細(xì)胞，特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡便快捷，質(zhì)量過硬，可滿足您的多種需求，對比其它品牌的試劑盒，優(yōu)勢如下：

　　1、多種標(biāo)記物(FITC、PE、APC、AF647/PI、7-AAD)選擇，滿足不同待測樣本和檢測儀器的需求;

　　2、多種試劑盒相關(guān)組分在售，靈活滿足不同的實驗需求;

　　3、檢測早期凋亡最理想的方法，不需固定環(huán)節(jié)從而避免相關(guān)的假陽性;

　　4、只需15-20分鐘，簡單快捷;

　　5、嚴(yán)格可靠的質(zhì)量控制，保證優(yōu)異的實驗結(jié)果;

　　6、專業(yè)的售前售后技術(shù)支持，幫助您更好完成凋亡實驗。

實驗效果圖如下：

圖：Jurkat細(xì)胞用1μM喜樹堿(Camptothecin) (左) 或未加藥 (右) 處理4 h，Annexin V-FITC/PI檢測試劑盒染色后FCM檢測。Annexin V-FITC單陽為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V-FITC和PI雙陽細(xì)胞為壞死或晚期凋亡細(xì)胞，PI單陽細(xì)胞為裸核細(xì)胞。

怎么樣，是不是非常地“炫”呢?